Kuidas hõõglamp töötab? Hõõglampide disainielementide ja tehniliste omaduste hindamine
Biokiip on DNA või valgu molekulide organiseeritud paigutamine spetsiaalsele kandjale – “platvormile”.
Platvorm on plaat, mille pindala on vaid 1 cm2 või veidi rohkem. See on valmistatud klaasist või plastist või ränist. Sellele saab asetada rangelt määratletud järjekorras palju DNA- või valgumolekule. Sellest tuleneb ka sõna "mikro" olemasolu terminis.
Molekulaaranalüüsi saab läbi viia biokiibil erinevaid aineid. Selleks kinnitatakse selle külge "ära tundvad" molekulid. Kõik need molekulid on tähistatud terminiga "sondimolekul" ja iga uuritavat molekuli nimetatakse
"sondimolekul".
Biokiibil oleva sondi molekuli määrab uurija ise, s.t. ta plaanib, millist molekuli uuritavas materjalis olevate molekulide hulgast otsida - vedelikust jne. Kui DNA-d uuritakse mikrokiibil, siis on tegemist DNA kiibiga, kui valgumolekuli, siis valgukiibiga.
Kuidas fikseeritakse sondi molekulid biokiibil?
Paljudes riikides kinnitatakse sondi molekulid otse klaasplaadile, s.t. substraadile laserite abil. Meie riigis asetatakse sondimolekulid geelrakkudesse, millest igaüks on alla 100 mikroni läbimõõduga, ja rakud kinnitatakse mikrokiibi tootmisprotsessi käigus plaadile. Kiibil olevate rakkude arv on jõudnud juba mitme tuhandeni.
Rakkudes on sondi molekulid keemiliselt seotud ja funktsionaalselt aktiivses olekus.
Kuna rakud on täidetud kolmemõõtmelise struktuuriga geeliga, siis nad hoiavad suur kogus pigem sondimolekulid kui kiibid, milles sondimolekulid on lihtsalt plaadile kinnitatud. Samuti on oluline, et keemiline reaktsioon sondi molekuli ja geelist rakku sisestatud proovimolekuli vahel kulgeb nagu vedelikes ja seega nagu elusorganismis.
Iga rakutüübi genoomi ja proteoomi uurimine normaalsetes tingimustes ja mis tahes haiguse korral võimaldab välja selgitada, milline geen või geenid põhjustavad konkreetset haigust.
DNA kiibi abil selgitatakse välja haiguse põhjus: defektid geeni või geenide struktuuris või muutused geenide aktiivsuses, kui selle struktuur on normaalne.
Valgukiibil määravad geeni “lagunemise” tagajärjed muutused selle tootes – valkudes rakus. Muutused rakugeenis või -valgus on nende märk või marker (inglise keelest mark - sign, label).
Seega: märgisega geen on markergeen ja märgisega valk on markervalk. Need markerid võimaldavad tuvastada patsiendil defektseid või haigeid rakke, mis on iseloomulikud konkreetsele haigusele, sealhulgas vähile. tüvirakk. Haiguse diagnoosimisel võrreldakse markergeeni ja valgumarkerit tõrjeks raku ja selle produkti - valkude - normaalse geeniga.
On selge, et DNA kiibil on sondi molekuliks markergeen ja eraldi rakus kontrollimiseks tavaline geen, valgu mikrokiibis võib sondi molekul olla kas antikeha või antigeen.
Biokiipide valmistamise meetodid
1. DNA või valgu molekulid sünteesitakse eelnevalt ja asetatakse seejärel maatriksile. Selle meetodi puuduseks on maatriksil oleva sondi molekuli madal tihedus – kuni 1000 molekuli – ja nende sünteesi töömahukas protsess.
Markergeeni koopiaid saab saada PCR-MMK meetodil, markervalgu koopiate jaoks sellist meetodit ei ole. Selle koopiaid saab luua markervalgu geeni mRNA sisestamisega bakterisse: E. coli või pärmirakkudesse.
2. DNA kiipide puhul sünteesitakse oligonukleotiidid otse maatriksil. Sellistel kiipidel on palju suurem sondimolekulide tihedus.
3. Oligonukleotiidide rakendamine maatriksis rangelt määratletud kohta, kasutades tindiprinterit.
Meie riigis valmistatakse biokiibid - DNA kiip ja valgukiip - esimesel meetodil.
Biokiip on uusim 21. sajandi meditsiiniseade. Markermolekulide põhjal võimaldab see:
1) diagnoosida mis tahes haigust: enne selle tekkimist või selle alguses;
2) leida organismist see või teine viirus, bakter ja vähirakud;
3) valgukiip suudab tuvastada ravimeid madala molekulmassiga ühendite hulgast paljudes analüüsitud materjalides;
4) nende probleemide lahendamine biokiipide peal saab tehtud tundide, mitte päevade vms.
Biokiipide tööpõhimõte ja analüüsi etapid
1. DNA kiip.
Teame, et DNA molekul koosneb kahest komplementaarsest ahelast. Iga ahela selgrooks on nelja lämmastiku aluse järjestus: adeniin (A), guaniin (G), tümiin (G) ja tsütosiin (C).
Sel juhul määrab ühe ahela aluste järjestus teise ahela aluste järjestuse: A-T ja G-C. Kui nende komplementaarsete aluste vahel tekivad spontaanselt vesiniksidemed, on need kaks ahelat ühendatud, st. hübridiseeruvad topeltheeliksiks ja hoiavad ahelaid koos. DNA kiibi tööpõhimõte põhineb komplementaarsete aluste võimel üksteisega seostuda: A koos T ja G C-ga.
Analüüsi etapid DNA kiibi abil
1. Tuntud markergeeni koopiad fikseeritakse kiibi rakkudes selle geeni ühe ahela kujul, s.o. selle "pooled" on cDNA.
2. Patsiendi vereplasmast eraldatakse markergeeni koopia, s.o. mRNA.
3. mRNA molekulil sünteesitakse ensüümi pöördtranskriptaasi abil markergeeni teine ahel, s.o. selle teine "pool" on cDNA. PCR-MMK-d levitavad seda cDNA-d – need on sondimolekulid ja need on märgistatud fluorestsentsvärviga.
4. Robot asetab proovimolekulid kiibile teatud rakkudesse koos vähi tüvirakkude markergeenide koopiaga.
Kui plasmaproovist pärit geenide cDNA on komplementaarne vastavates rakkudes oleva cDNA-ga, toimub nende vahel hübridiseerumine ja sellised rakud hakkavad helendama. Kiipi skaneeritakse laseriga, jälgides fluorestsentssignaali intensiivsust igas rakus. See tähendab, et plasmas on markergeenid, mis tähendab, et patsiendi kehas on vähi tüvirakke.
Kui nende molekulide vahel ei ole hübridisatsiooni, siis pole selles plasmaproovis vähi tüvirakkude markergeeni.
Kui on olemas mutatsiooniga geen, hübridiseerub selle kiibil olev cDNA selle mutatsiooniga sondi molekuli cDNA-ga. Kui see on wt53 supressorgeen, võib see viidata ka vähi tüvirakkude või -rakkude olemasolule patsiendi kehas.
Vähirakk tekib koe tüvirakust, kuna sellesse on kaasatud lootevalgu geenid. Seetõttu sisaldavad patsiendi plasmaproovi molekulid nende geenide cDNA-sid ja nende puudumist kontrollis.
Mida madalam on epimutantsete ja mutantsete markergeenide tiiter patsiendi plasmaproovis, seda vähem on tema kehas vähirakke.
Vähirakkude tuvastamine patsiendi vereplasma või muude bioloogiliste vedelike proovis - uriin, sülg, pisaravedelik markergeenide abil võimaldab diagnoosida vähki ja markergeenide abil invasiooni omadusi vähirakk- vähi mikrometastaasid. Ja see on ammu enne, kui neid tuvastatakse standardmeetoditega - ultraheli, radiograafia, CT skaneerimine ja jne.
Biokiip suudab markergeenide abil tuvastada haiguse ohu. Seega, kui leitakse markergeene, kuid nende saadusi – valke – pole veel rakus, siis on tegemist eelhaiguse tuvastamisega. Seoses vähiga on need vähieelsed rakud. Kuna antud juhul saab biokiip paljastada vaid haiguse tõenäosuse, siis sellist kiipi veel sertifitseeritud ei ole.
Patsiendi vereplasma on peamine reservuaar, kuhu markergeenid tungivad surevatest defektsetest või haigetest rakkudest erinevatest elunditest, sealhulgas vähirakkudest. Sellised rakud kehas võivad surra nekroosi ja apoptoosi tõttu ning nende geenid läbi rakkudevaheline vedelik seejärel tungida verre.
Markergeenide madal tiiter patsiendi vereplasmas DNA kiibil analüüsituna ja nende produkti, valkude puudumine võivad tähendada haiguseeelset ja kui need on olemas, siis haigust. Samas mõttes kehtib see ka vähi kohta. See võib tähendada vähi varajast diagnoosimist – selle II taset.
2. Valgukiip.
Valguanalüüsi kiibi struktuur on sama, mis DNA kiipide oma. Ainult need kiibid, millel toimub ensümaatiline reaktsioon, on rakkude paigutusega haruldasemad ja need, millel toimub DNA reaktsioon, on sagedamini.
Markervalgud on geeni või geenide "lagunemise" produkt; nad muudavad normaalse raku konkreetse haiguse jaoks defektseks või haigeks rakuks. Need valgud ilmuvad rakkude pinnale ja on antigeenvalgud ning igal haigusel on oma.
Vähi tüvirakk arendab loote valke ja retseptorvalke, mida normaalsel tüvirakul ei leidu. Kas need on antigeenvalgud, pole lahendatud küsimus.
Valgukiibis sondi molekulina, s.o. Defektse või haige raku valgumarkeriks võib olla valk-antigeen, seejärel määratakse patsiendi seerumis selle vastased antikehad. Kui antikeha võetakse koos sondimolekuliga, otsitakse antigeenvalku patsiendi vereseerumis.
Seoses inimese genoomi dešifreerimisega on vaja analüüsida suure hulga valkude funktsioone rakkudes erinevad tüübid, sealhulgas varem tundmatuid. Mikrokiibi erinevates rakkudes saab fikseerida tuhandeid valke ja samaaegselt analüüsida nende võimet: siduda tuntud ligandit, katalüüsida teatud ensümaatilist reaktsiooni, suhelda antikehade, madala molekulmassiga ühenditega jne.
Vähirakus on oluline lisaks markervalkudele uurida retseptorvalke ja nende vastaseid antikehi valke, invasiooniomadusi, veresoonte endoteeli kasvufaktorit-1 ja selle retseptorvalku vereloome raku pinnal jne.
Valgukiibi tööpõhimõte
See põhineb ka kaasatud molekulide, kuid valgu molekulide komplementaarsusel.
1. Antigeen koos selle antikehaga. Antigeen on mis tahes aine, mis tavaliselt sisaldab teatud tüüpi valku, mis võib põhjustada immuunvastuse.
Antikeha on valgu molekul, mida sekreteerib üks immuunsüsteemi rakudest. Selle molekuli kuju ja jaotus elektrilaeng oma pinnal muudavad selle võimeliseks siduma antigeeni, mis on selle kuju ja laengujaotuse poolest komplementaarne.
Esimest korda juba 1942. aastal. Nobeli preemia laureaat L. Pauling ja tema kolleegid esitasid õige postulaadi, et antigeeni ja selle antikehade kolmemõõtmeline struktuur
Need on üksteist täiendavad ja seega "vastutavad" antigeen-antikeha kompleksi moodustamise eest.
2. Substraat oma ensüümiga. Topokeemilise vastavuse hüpoteesi põhjal on ensüümi toime spetsiifilisus seotud selle substraadi osa äratundmisega, mis katalüüsi käigus ei muutu. Substraadi selle osa ja ensüümi substraadi keskpunkti vahel tekivad punktkontaktid ja vesiniksidemed.
3. Madala molekulmassiga ühendiga valk. Valgu inhibeerimiseks on vajalik nendevaheline ühendus - täiendav pinnaühendus valgu molekuli aktiivsete saitidega,
4. Madala molekulmassiga ühendiga ensüüm. Ensüümid ja muud valgud loovad kõik vähiraku omadused, mistõttu on need ravimite peamised sihtmärgid. Madala molekulmassiga ühendiga ensüümi blokeerimiseks on vajalik ka nendevaheline komplementaarsus: ühendi molekuli pind peab olema substraadi piirkonna pinna koopia, mis katalüüsi ajal ei muutu.
Valgukiibi analüüsi etapid
1. Kiibi rakkudes fikseeritakse tuntud valk-antikeha valgu vastu, mis tekitab konkreetse haiguse defektse või haige raku. Valk, mida otsite, on markervalk.
2. Patsiendilt kogutakse analüüsiks seerumiproov. Proovile lisatakse fluorestseeruv värvaine – iga markervalgu molekul saab selle aine.
3. Roboti abil asetatakse kiibi teatud rakkudesse proovi seerumitilgad. Sondimolekulid otsivad sondimolekulide hulgast komplementaarseid molekule. Kui selline molekul on olemas, siis see seostub kiibi rakus oleva sondi molekuliga; nende vahel toimub keemiline reaktsioon ja see hakkab helendama.
4. Rakud, milles ilmub ere sära, näitavad soovitud markervalgu olemasolu. Kuna see valk on konkreetse haiguse defektse või haige raku marker, näitab see selle haiguse algust patsiendil. Samamoodi määravad vähiraku(te) olemasolu patsiendi kehas nende markervalgud.
Kui kiibi rakkudes on fikseeritud valk-antigeen, siis otsitakse markervalgu vastaseid antikehi patsiendi vereseerumis. Kui seerum sisaldab markervalgu vastaseid antikehi, viitab see vähirakkude olemasolule patsiendi kehas, s.t. patsient on haige. Ja kasutades vähirakkude invasiooni omaduste markervalke, näiteks valgu Mts1 olemasolu ja muud, on võimalik registreerida vähirakkude mikrometastaase kuskil patsiendi kehas.
Teame juba, et valgud, mida toodetakse vähirakkudes, kuid mis puuduvad normaalsetes rakkudes, on markervalgud või antigeenid. Selliste valkude olemasolu on märk sellest, et geen, mis põhjustab normaalse raku degenereerumist vähirakuks, on alustanud oma hävitavat tööd. Vähiraku(te) identifitseerimine markervalkude abil võimaldab diagnoosida vähki või selle mikrometastaase ammu enne sümptomite avastamist patsiendil. Markervalgu tiiter patsiendi vereseerumis määrab vähirakkude arvu tema kehas. Vähirakkudest pärinevate markervalkude madal tiiter patsiendi vereseerumis, aga ka teistes patsiendi vedelikes on märk vähesest vähirakkude arvust patsiendi kehas. Sellest võib saada vähi varane diagnoos – selle II tase.
Niisiis, 21. sajandil, kui tuvastatakse markergeenid ja markervalgud, mis põhjustavad konkreetset haigust, muutub selle diagnoos, sealhulgas vähk, varakult, s.t. kahel tasemel: 1) "enne algust" - markergeenide järgi ja 2) "alguses" - markervalkude järgi.
Markergeenid ja markervalgud defektses või haiges rakus on uute ravimite sihtmärgid või sihtmärgid. Nende baasil luuakse ravimeid ja muid vahendeid, sealhulgas vaktsiine. Tänu sihtmolekulide komplementaarsusele toimivad ravimid selektiivselt, kahjustamata normaalseid rakke.
Arst, toimides haiguse markergeenidele, suudab seda ennetada ja raku markervalkudele toimides on võimalik seda "embrüos" ravida.
Nendel kahel viisil saab arst nii-öelda täieliku võimu mis tahes haiguse üle rakutasandil.
Markergeenide ja markervalkude otsimine patsiendi keha erinevates keskkondades saab kiiresti ja täpselt läbi viia biokiipidel, lisaks saab markergeene tuvastada kõige täpsemate meetoditega: PCR-MMK ja MS-PCR. See tähendab revolutsiooni meditsiinis.
Teadlased tuvastavad markergeenid ja markervalgud, mis põhjustavad konkreetset haigust, sealhulgas vähiraku esinemist. Siis on võimalik välja töötada minimaalne markergeenide ja markervalkude komplekt mis tahes haiguse varaseks diagnoosimiseks. Neid täiendatakse ja täpsustatakse uute teadmiste saamisel. Need on haiguse geeni- ja valguprofiilid, mis kantakse üle biokiipidele.
Inimese testimisel konkreetse haiguse markerite suhtes DNA kiibi ja valgukiibi abil on mitmeid eeliseid.
Negatiivne tulemus rõõmustab inimest ja võib päästa ta tavapäraste meetoditega läbivaatusest: ultraheliuuringud, radiograafia jne.
Positiivne tulemus annab inimesele nii võimaluse kui ka aja võtta meetmeid haiguse riski vähendamiseks või, kui see algab, alustada sobivat ravi.
Eriti oluline on vähi varajane diagnoosimine. See on tingitud asjaolust, et esiteks on vähi põhjus vähirakk ja see pärineb selle peremeesorganismi rakust ning teiseks ei olnud kuni viimase ajani teada absoluutseid erinevusi vähiraku ja normaalse raku vahel. .
Endiselt arvatakse, et igat tüüpi vähirakke iseloomustavad "oma" geenid ja valgud. Kuid igat tüüpi raku genoom on sama. Kui nõustume, et igat tüüpi raku vähirakk on "oma omast", siis miks on mis tahes tüüpi vähiraku omadused samad?
Rakutüüp tekib mõnede geenide represseerimisel – metüleerimise ja teiste geenide ekspressiooni tõttu – nende promootori demetüleerimise tõttu.
Samuti on nüüdseks tõestatud, et mis tahes tüüpi rakk muutub vähkkasvajaks selles sisalduvate lootevalgu geenide derepressiooni tõttu. See tähendab, et rakutüübi teke ja vähiraku tekkimine normaalsest rakust on üksteisest sõltumatud protsessid. Nende kahe fakti põhjal võime eeldada, et mis tahes tüüpi vähi tüvirakkude jaoks peavad olema ühised markergeenid ja nende tooted, valgud.
Levinud geenid ja nende tooted - valgud - võivad olla: geen ja selle ensüüm - telomeraas, geen ja valk kodeeritud "5T4", okt-4 geen ja Oct-4 valk, Nanog geen ja valk, mts 1 geen ja Mts 1 valk, osteopontiini geen ja valk jne.
Kui see kinnitust leiab, oleks see tõeline läbimurre paljude, kui mitte kõigi vähiprobleemide lahendamisel:
Mis tahes tüüpi vähi tüvirakkude varajane ja täpne diagnoosimine, mis põhineb ühisel markergeenil ja selle produktil, markervalgul;
Universaalsed ravimid ja abinõud, sealhulgas vaktsiin vähi tüvirakkude ja nende metastaaside vastu.
Igaüks meist on läbinud kliinikutes uuringud ja tal on aimu, kui palju aega ja vaeva nad nõuavad. Võtke hunnik analüüse, liitrit verd, seejärel kannatage nädalapikkust ootamist, et arstidel oleks aega oma laborites kontrollida meie katseklaasides bakterite ja viiruste olemasolu. Peagi võivad asjad aga kardinaalselt muutuda ning uuringud enam inimesi ei hirmuta. Mis aitab kõiki haigusi kordades kiiremini diagnoosida?
Umbes kakskümmend aastat tagasi töötati see välja bioloogilise kiibi tehnoloogia. See arendus kuulub Molekulaarbioloogia Instituudile. Engelhardt. Võib öelda, et kogu selle paarikümne aasta jooksul kogus arendus riiulitel tolmu ja sellega ei tegelenud keegi. Kuid nüüd on teadlased otsustanud kiipide kallal tööd jätkata ja kavatsevad lähiajal toota terve rea kiipe. Tehnoloogia peamine eelis võrreldes meie tavapäraste testimisprotseduuridega on selle tõhusus.
On mitmeid haigusi, mida ei saa isegi diagnoosida parimad arstid selleks kulub mitu nädalat. Näiteks tuberkuloosi tekitaja tuvastamiseks ja mõistmiseks, milliseid ravimeid tuleb patsiendile välja kirjutada, võivad arstid kulutada isegi kümme nädalat ja see on haige keha jaoks tohutu aeg. Kogu selle aja lamab patsient haiglas, võttes ravimeid, mis ei anna 100% garantiid, et need keha aitavad. Mõne patsiendi jaoks sobivad need ravimid, kuid teistele ei too need mingit kasu. Seetõttu võib inimene kulutada haiglas ravile ja hooldusele palju raha, kuid korralikku ravi ta ei saa. Vaid üks näide näitab, kui kurb on praegu olukord meditsiinis.
Bioloogiliste kiipide tutvustus
Bioloogilised kiibid- see on võime analüüsida patsiendi tervist mitte rohkem kui 24 tunni jooksul. Need ei ole mitte ainult patsiendi jaoks suurepärane aja- ja rahasääst, vaid aitavad ka kogu riigi tervishoiusüsteemil säästa märkimisväärse osa eelarvest. Selle tehnoloogia kasutuselevõtt on tohutu investeering meditsiinivaldkonda ja kokkuhoid. Raha riigid. On isegi ametlikke andmeid, mis ütlevad, et vaid aastaga saab riik tänu biokiipidele mõistlikult säästa 5 miljardit rubla.
Patsiendi kokkuhoid põhineb asjaolul, et ta ei pea kulutama raha tohutul hulgal testidele, et kontrollida kogu oma keha haiguse esinemise suhtes. Üks keemiateaduste kandidaatidest väitis, et tänu vaid ühele analüüsile uus tehnoloogia patsient saab kontrollida oma keha kaheksa vähimarkeri olemasolu suhtes. Veelgi enam, tänaste andmete kohaselt on kiip võimeline haigust täpselt tuvastama ja 90% tõenäosusega diagnoosima. õigel viisil. Nüüd peab inimene maksma umbes seitse tuhat rubla, et end kõigi levinud vähihaiguste suhtes testida. Kiibiga kulutaks patsient mitte rohkem kui tuhat rubla. Võtke tuberkuloos - pärast tehnoloogia kasutuselevõttu vajab patsient umbes viissada rubla, et uurida selle haiguse esinemist. Pange tähele, et välismaal on ühe kiibi hind umbes kaks dollarit.
Mikrobioloogid viisid läbi oma uuringud ja tõdesid, et tehnoloogia abil on tõepoolest kõik võimalused diagnoosida tohutul hulgal haigusi. lühike periood aega. Näiteks suudab kiip tuvastada mitut tüüpi leukeemiat, HIV-i, B- ja C-hepatiiti, mitut tüüpi grippi, herpese ja paljusid muid haigusi. Analüüsid valmivad paari tunni jooksul peale uuringut. Kui on epideemia võimalus, biokiipide kasutamine mängib meditsiinis oma tõhususe tõttu olulist rolli.
Vähem kui ööpäeva pärast on spetsialistidel võimalus hinnata teatud viirustega kaasnevaid ohuriske. Samuti saavad nad määrata pandeemia taseme. Ja see on juba tõestatud. kandidaat bioloogiateadused Gryadunov ütles, et paljud inimesed kartsid seda H1N1-gripi ilmnemise ajal kohutavalt, kuigi tegelikult ei kujutanud see inimestele suurt ohtu, kuna selle valkjas kest oli äärmiselt haavatav. Linnugripi puhul puudub epideemia võimalus, kuna see ei kandu ühelt inimese haiguselt teisele.
Hele märk
Kiipide disain pole nii keeruline. Seal on miniatuurne plaat, millele maatriks on kinnitatud. Maatriks sisaldab palju rakke. Nende suurus ei ületa sada mikronit. Vaid üks ruutmillimeeter maatriksit mahutab mitusada rakku. Neid võib võrrelda väikeste katseklaasidega.
Bioloogiliste mikrokiipide arendamisega isiklikult tegelev Aleksandr Tšudinov ütles, et tehnoloogia aluseks on DNA molekulide eriomadus. See on topeltspiraal, mis on ehitatud kahe polümeeri ahela abil. Ehituspõhimõte on üksteist täiendav.
Teadlased peavad iseseisvalt looma ühe DNA tüki ahela; nad võivad luua ka oligonukleotiidi. Kõige olulisem asi, mida arvestada õige järjestus keti ehitamine. Jada, mis moodustub pärast haigust paljastavat mutatsiooni, on õige. Teadlased peavad need segmendid siduma kiibielemendiga. Järgmisena tuleb maatriks asetada spetsiaalsesse korpusesse, kus see on hermeetiliselt kaitstud. Jääb üle vaid laborandi teha oma töö – teha pädev analüüs. Prooviks võib olla verest või süljest võetud DNA viirus. Kas on võimalik uurida konkreetse patsiendi DNA-d? Muidugi, kui on näiteks geneetiline eelsoodumus konkreetsele haigusele, saab selle tuvastada mõne tunni jooksul. On isegi võimalusi diagnoosida individuaalne taluvus teatud haiguste suhtes.
Laborandi töö on järgmine. Saadud pilt tuleb saata katseklaasi, misjärel lisada veel mitu ensüümi ja nukleotiide (hulk nukleotiide on märgistatud fluorestseeruva ainega).
Selle tulemusena algab sünteesireaktsioon. See toob kaasa DNA segmentide arvu märkimisväärse suurenemise. Ja mis kõige tähtsam, igal segmendil on fluorestseeruv marker. Nüüd valatakse "valmis" proov kiibile. Kui on järjestusi, mis sisaldavad mutatsioone, moodustub nende seos segmentidega. Nende segmentide järjestusi on seni muudetud. Järjestuse tulemusena värvitakse soovitud lahter markeriga.
Töö sellega ei lõpe, sest kiibi töötlemise eest teatud lahustega tuleb veel hoolt kanda. Pärast seda protseduuri saadetakse see spetsiaalsesse lugemisseadmesse. Seda nimetatakse arvutipõhiseks fluorestsentsanalüsaatoriks. Nüüd hakkab programm tööle. Ta analüüsib helendavate rakkude mustrit, tänu millele ilmub teave konkreetselt nende DNA segmentide kohta, mis on muutunud. Selle tulemusena on spetsialistil andmed selle kohta, millised geenid on muutunud, millised haigused patsiendil on, millised bakterid ja viirused tema keha mõjutavad.
Lahtri formaat on kolmemõõtmeline. Ja see mängib teadlaste kätes, kuna on võimalik kasutada tohutul hulgal DNA segmente. Mida rohkem segmente, seda suurem on analüüsitulemuste täpsusprotsent. Tänapäeval on isegi spetsiaalsed 3D-rakud, millesse saad saata molekule ja olla kindel, et need kaotavad oma bioloogilised omadused. Sel eesmärgil loodi hüdrogeel, mis on võimeline säilitama omadusi. Hüdrogeeli võib võrrelda keskkonnaga, kus molekulid elavad bioloogilistes struktuurides, erinevusi on väga vähe. Tänu sellistele arengutele biokiibid võivad töötada 12 kuud. Nende transportimise osas küsimusi ei teki – eriti kriitilisi tehnotingimusi pole vaja.
Kuidas tehnikaga praegu lood on?
Siiani te kliinikutes biokiipe ei näe, kuna töö on alles kliiniliste uuringute staadiumis. Kiibidiagnoose pimesi ei usaldata – neid kontrollitakse meie tavapäraste haiguste tuvastamise meetoditega. Sellegipoolest on kõik mikrobioloogid kindlad, et biokiibid on tulevik; me peame lihtsalt sellele tehnoloogiale piisavalt tähelepanu pöörama.
Pange tähele, et 2016. aastal olid paljud uuringud suunatud Alzheimeri tõvega võitlemisele. Aktiivselt uuriti ka skisofreeniat ja alkoholismi. Tähelepanu pöörati ka diagnostilise testimissüsteemi arendamisele, mille aluseks on just nimelt biokiipide kasutamine, mis suudab tuvastada eelmainitud haiguste eelsoodumuse.
Ei saa öelda, et kiibid on arendus, mida ei saa kasutada mujal kui tervishoius. Biokiipide vastu on huvi üles näidanud isegi õiguskaitseorganid. Spetsiaalsed kiibid on spetsiaalselt selle piirkonna jaoks välja töötatud, et tulla toime kahekümne kolme markeri tuvastamisega. See on suur arv, sest sellest piisab kümnete tuhandete erinevate inimgenoomi variantide tuvastamiseks. Jämedalt öeldes annab kiip väga täpset teavet selle kohta, kas isik on võimeline toime panema konkreetse kuriteo. Test nõuab ainult bioloogilisi proove, milleks võivad olla sülg, juuksed jne.
Loomulikult ei ole kiibi abil veel uurimistoiminguid tehtud, kuna pole veel tõestatud, kui täpne ja tõene on selle info. Kuid teadlased ütlevad, et selle tehnoloogia kasutamisel on õiguskaitsevaldkonna arengule äärmiselt kasulik mõju. Mida me saame lõpuks öelda? Ajastu, mis varem tundus molekulaarbioloogias fantastiline, on vaid lühikese aja kaugusel.
Biokiip vähi varajaseks diagnoosimiseks
Argonne'i riikliku labori, tuumaenergia uurimiskeskuse (Chicago, Illinois) teadlased on välja töötanud biokiibi, mis suudab diagnoosida teatud tüüpi vähki enne sümptomite ilmnemist.
Eprogen on selle tehnoloogia litsentsinud ja kasutab seda uute vähi biomarkerite leidmiseks. Kasvajad, isegi kõige varasemates, asümptomaatilises staadiumis, toodavad valke, mis sisenevad vereringesse ja käivitavad immuunreaktsioonid, eelkõige antikehade sünteesi. Ettevõtte spetsialistid väidavad, et tervete inimeste ja vähihaigete autoantikehade profiilide võrdlemine on paljulubav meetod haiguste varajaste näitajate otsimiseks.
Nende kasutatav protsess, mida nimetatakse kahemõõtmeliseks valkude fraktsioneerimiseks, võimaldab neil pahaloomulistest rakkudest sorteerida tuhandeid erinevaid valke nende elektrilaengu ja hüdrofoobsuse erinevuste põhjal. Seda meetodit kasutades saavad teadlased 960 valgufraktsiooni, mis asetatakse 96 süvendiga plaate sisaldavasse biokiipi. Pärast seda töödeldakse biokiipi eelnevalt sünteesitud autoantikehadega immuunsussüsteem vähihaiged.
Patsiendi autoantikehade kasutamine diagnoosimiseks võimaldab arstidel kohandada ravi vastavalt nende individuaalsele autoantikehade profiilile. Uue meetodi ainulaadsus seisneb selles, et teadlased kasutavad reaalseid andmeid inimese haiguse kohta, et saada uut üksikasjalikumat diagnostilist teavet, mida spetsialistid saavad kasutada vähi uurimiseks ja raviks.
Tehnoloogia välja töötanud Argonne National Laboratory spetsialisti Daniel Schabackeri sõnul on biokiibid juba näidanud diagnostilises meditsiinis suurt potentsiaali. Lisaks Eprogenile on tehnoloogia litsentsinud veel kolm ettevõtet. Üks neist, Akonni Biosystems, on selle põhjal välja töötanud juba mitukümmend testi, mis on toodetud kaubamärgi TruArray all. Teine ettevõte, Safeguard Biosystems, on litsentsinud biokiipe veterinaardiagnostika komplektide loomiseks.
Näiteks ülaosa haiguste diagnoosimisel hingamisteed Patsiendi suukaudses tampoonis sisalduvad antikehad või DNA seonduvad biokiibile kantud molekulidega. Pärast töötlemist hakkavad biokiibi süvendid, milles selline sidumine toimunud, helendama. Spetsiaalne programm dešifreerib arvuti abil skaneeritud pildi, arvutab välja konkreetse nakkustekitaja esinemise statistilise tõenäosuse ja annab arstile teavet.
Diagnostikatööriistade nagu TruArray väljatöötamine võib diagnostikat revolutsiooniliselt muuta, sest... see võimaldab samaaegselt diagnoosida suurt hulka haigusi. Üks neist ainulaadsed omadused Meetod on bakteriaalse ja viirusliku iseloomuga infektsioonide samaaegse testimise võimalus.
Analüüs biokiibi abil võtab aega umbes 30 minutit ning tagab konfidentsiaalsuse ja kõrge diagnostilise täpsuse, sest arst saab kabinetist lahkumata praktiliselt patsiendi silme all kindlaks teha haiguse olemuse ja selle arengujärgu.
Patsientidel, kellel on suhkurtõbi väikesed tihedad LDL-C osakesed sisaldavad glükosüülitudApoIN
Charlton-Menys (Manchesteri ülikool, Ühendkuningriik) hindas erinevate lipiidide alamfraktsioonide glükosüülimise astet 44 diabeediga vabatahtlikul. Selgus, et glükosüülitud Apo B keskmine tase oli 3,0 mg/dl, kusjuures 84,6% glükosüülitud Apo B-st sisaldub LDL-C-s ja 67,8% kõige aterogeensemas alafraktsioonis, nimelt X-LDL väikestes tihedates osakestes.
Väikeste tihedate LDL-C osakeste tase on kõige enam korrelatsioonis intima-meedia paksusega unearterid
Tetsuo Shoji (Osaka City University Graduate School of Medicine, Jaapan) ja kolleegid määrasid lipiidide taseme 326 patsiendil, keda uuriti unearteri kehamassiindeksi suhtes. Teadlased näitasid tugevat korrelatsiooni väikese tiheda LDL-C taseme ja unearteri intima-meedia paksuse vahel (korrelatsioonikoefitsient 0,441). Teiste lipiidide korrelatsioon intima-meedia paksusega oli järgmine: apolipoproteiin B (0,279), LDL-C 0,249 ja triglütseriidid (0,175). Kõrge C-reaktiivse valgu tasemega patsientidel oli madala tihe LDL-C tase madalam kui patsientidel madalad tasemed C-reaktiivne valk.
Ateroskleroos 2008; Eelnev veebiväljaanne.
AIDS, tuberkuloos, leukeemia, B- ja C-hepatiit, rõuged, siberi katk, katk, vähk, koolera, difteeria, teetanus, stafülokokkinfektsioonid – Venemaa teadlaste loodud universaalne diagnostikavahend võib aidata nende haiguste vastu võidelda.
Mis on diagnoos, milline on ravi. See tõde on ilmne isegi amatööridele. Kui arstid suudaksid läbi viia iga patsiendi paljude geenide, rakusiseste valkude ja raku sekretsiooni individuaalse analüüsi, oleksid tulemused äärmiselt informatiivsed ja tõhusad. Selline mitmeparameetriline analüüs on aga keeruline ja väga kulukas ülesanne. Seetõttu on juurdepääsetav molekulaardiagnostika, mis põhineb põhimõtteliselt uuel lähenemisviisil, mis võimaldab paljude haiguste põhjuste kiiret ja usaldusväärset tuvastamist, uurimisrühmadele ja kliinikutele.
Nendele soovidele vastab bioloogiliste mikrokiipide (biokiipide) tehnoloogia, mis on välja töötatud nimelises molekulaarbioloogia instituudis. V.A. Engelhardt RAS (IMB) akadeemik Andrei Mirzabekovi (1937-2003) juhtimisel.
Biokiibid, nagu elektroonilised mikrokiibid, mis töötlevad digitaalse teabe massiive, on mõeldud suurte koguste molekulaarseks lugemiseks ja töötlemiseks bioloogiline teave bioloogilise materjali mikroproovi mitmeparameetrilise analüüsi läbiviimisel.
Biokiipide aluseks on paljude poolkerakujuliste hüdrogeelirakkude maatriks (läbimõõduga umbes 100 mikronit), millest igaüks sisaldab molekulaarsonde, mis on spetsiifilised ühele paljudest bioloogilistest molekulidest või nende fragmentidest (näiteks DNA või RNA järjestused, valgud). Ühel ruutsentimeetrit saab paigutada kuni tuhat biokiibi rakku, mis on mõeldud erinevatel eesmärkidel: erinevate pärilike ja onkoloogiliste haiguste eelsoodumusega seotud mutatsioonide tuvastamiseks; bakterite ja viiruste tuvastamiseks; ravimiresistentsete vormide tekkeni viivate mikroorganismide mutatsioonide tuvastamine nakkushaigused.
Analüüsi läbiviimiseks läbib patsiendi vere või muu uuritava vedeliku proov eeltöötluse, mille käigus märgistatakse selles olevad molekulid fluorestsentsvärviga (mis teatud lainepikkusega valgusega kiiritades helendab). Seejärel kantakse proov spetsiaalsesse mikrokambrisse asetatud biokiibile. Iga tüüpi proovimolekulid interakteeruvad neile spetsiifiliste sondidega, mis paiknevad üksikutes mikrokiibi rakkudes, mida saab registreerida vastava biokiibi raku sära intensiivsusega. Paljude biokiibi rakkude helendusmustri põhjal määrab spetsiaalne analüsaator kvantitatiivselt DNA, RNA või valkude komplekti iseloomulike järjestuste olemasolu uuritavas proovis. IMB on välja töötanud analüsaatorid teaduslikud uuringud, mis on võimelised analüüsima tuhandeid rakke sisaldavaid biokiipe, ja kaasaskantavaid kliinilisi analüsaatoreid tavapärasteks meditsiinilisteks rakendusteks, mis võimaldavad analüüsida ühe kuni kahesaja rakuga biokiipe.
Tänaseks on IMB loonud biokiipide diagnostilised versioonid, mis võimaldavad tuvastada paljude ohtlike haiguste viiruseid. Tuberkuloosi diagnoosimisel koos selle ravimiresistentsete vormide samaaegse tuvastamisega lühendatakse analüüsi aega 2 kuult 1 päevani. See võimaldab kiiresti välja kirjutada reservraviaineid neile patsientidele, kellel on avastatud tuberkuloosivormid, mis on resistentsed tavaliselt kasutatavate ravimite suhtes (üle 10% juhtudest). Nagu näitavad enam kui 3000 patsiendi analüüsi tulemused, ületab meetodi usaldusväärsus 90%. Esimest korda maailmas sertifitseeriti meditsiiniliseks kasutamiseks ravimresistentsete tuberkuloosivormide kiire tuvastamise meetod, mis põhineb kodumaisel originaalsel biokiibitehnoloogial (Vene Föderatsiooni tervishoiu- ja sotsiaalarengu ministeerium). Seda tehnikat kasutatakse juba 8 piirkonnas meditsiinikeskused Venemaal, aga ka mitmes uurimisinstituudis, mis tegelevad nakkushaiguste patogeenide tuvastamise probleemidega.
Loodud on biokiipide variandid, mis tuvastavad ja tüpiseerivad leukeemiani viivate kromosoomide ümberkorralduste saadusi, identifitseerides AIDSi, B- ja C-hepatiidi viirusi.Biokiipe arendatakse välja stafülokoki, koolera, difteeria, teetanuse ja siberi katku toksiinide ning patogeenide tuvastamiseks. siberi katk ja katkud, mida saab kasutada bioterrorismis. Biokiibid on loodud rõugeviiruste liikide määramiseks ja nende eristatavuse määramiseks teiste päritolult sarnaste haiguste patogeenidest. kliinilised ilmingud(herpes, tuulerõuged). Biokiibid on välja töötatud patsientide eelsoodumuse tuvastamiseks teatud vähivormide tekkeks ja individuaalse tundlikkuse määramiseks kasvajavastases ravis kasutatavate ravimite suhtes.
Uus universaalne diagnostikavahend on juba nõutud meditsiiniasutustes üle kogu riigi. Peamine tarbija on täna Venemaa tervishoiuministeerium. Ta tegutseb kiirdiagnostika jaoks mõeldud biokiipide kliendina erinevaid vorme tuberkuloos. Pole üllatav, et arstid pöörasid ennekõike tähelepanu tehnoloogiale, mis võimaldab neil sellega tõhusamalt võidelda ohtlik haigus. Praegu tuvastatakse tuberkuloosi esinemine röntgenuuringu abil, mille järel hakatakse patsienti ravima "esimese rea" ravimitega - standardkomplektiga, mida reeglina kasutatakse kõigi tuberkuloosihaigete jaoks. Samal ajal viiakse läbi selle patsiendi tuberkuloosi patogeeni resistentsuse bakterioloogiline analüüs kasutatud ravimite suhtes. See analüüs võtab aega umbes 3 kuud, pärast mida selgub, et ligikaudu 10 protsendil patsientidest on tuberkuloosi ravimresistentne vorm, millega kaasneb vajadus minna üle ravile "reservravimitega". Tagajärjeks on eksliku ravi tõttu nõrgenenud patsiendi tervis, mõttetu raha kulutamine ravimitele ja patsiendi haiglas hoidmisele, ravimiresistentsete tuberkuloosivormide levik haigete kokkupuutel selle haiguse erinevate vormidega. Ilmselgelt on tänapäeval tuberkuloosi ravimisel kõige olulisem probleem võimalikult kiiresti kindlaks teha, milline haigusvorm patsiendil areneb. Bioloogiline mikrokiibi tehnoloogia võimaldab selle analüüsi teha ühe päevaga.
Uue tehnoloogia turule toomine meditsiiniteenused teostab firma "BIOCHIP-IMB", mis kuulub Molekulaarbioloogia Instituudile, kes on sõlminud lepingu Vene Föderatsiooni tervishoiuministeeriumiga biokiipide tarnimiseks riigi tuberkuloosikliinikute võrgustikku. Pilootprojekti kohaselt on ettevõte "BIOCHIP-IMB" tehnoloogia juba juurutanud kaheksas riigi meditsiinikeskuses, mis asuvad Moskvas, Jekaterinburgis, Novosibirskis, Kaasanis, Peterburis ja Saratovis.
Nagu näeme, on bioloogiliste mikrokiipide kasutusvaldkond tohutu ning ainulaadse diagnostikavahendi loojad laiendavad selle kasutusala pidevalt. Instituudi labori meeskond loob biokiipe gripiviiruse tüpiseerimiseks, isikute tuvastamiseks ja äratundmiseks, samuti DNA-valgu interaktsioonide spetsiifilisuse uurimiseks.
(Tuginedes materjalidele vestlusest bioloogiliste mikrokiipide labori juhataja prof. A. Zasedatelev ja bioloogiateaduste doktor V. E. Barskyga).
Jelena Ukusova, Avatud Majanduse Keskus
Avamine funktsionaalne tähtsus tuhandetest geenidest ja paljude ensüümide molekulaarsetest toimemehhanismidest sai bioloogias pöördeline sündmus, millel oli ja on 21. sajandi meditsiini arengule tohutu mõju. Teadlastele ja arstidele on avanenud ainulaadsed võimalused selgitada välja paljude nakkushaiguste ja pärilikud haigused, samuti arengut tõhusad meetodid nende ravi. Uute diagnostikameetodite väljatöötamine eeldas omakorda ka uute tehnoloogiate loomist bioloogiliste proovide multiparameetriliseks analüüsiks, mille abil on võimalik üheaegselt uurida paljusid erinevate haiguste valgu- ja DNA markereid, funktsionaalselt olulisi bioloogilisi makromolekule ja nende komplekse. . Nii tekkiski bioloogiliste mikrokiipide tehnoloogia, mis on nagu elektroonilised mikrokiibidki võimeline eraldama ja töötlema tohutul hulgal informatsiooni ühest väikesest konkreetselt patsiendilt saadud bioloogilise materjali proovist.
Dmitri Aleksandrovitš Grjadunov— nimelise Molekulaarbioloogia Instituudi bioloogiateaduste kandidaat, teadusuuringute asedirektor ja molekulaardiagnostika tehnoloogiate labori juhataja. V. A. Engelhardt RAS (Moskva). Vene Föderatsiooni noorteadlaste riikliku preemia (2003), Venemaa Galeni auhinna (2014) laureaat. 60 teadusartikli ja 27 patendi autor ja kaasautor. |
Aleksander Sergejevitš Zasedatelev— nimelise Molekulaarbioloogia Instituudi füüsika- ja matemaatikateaduste doktor, professor, bioloogiliste mikrokiipide labori juhataja. V. A. Engelhardt RAS (Moskva), Moskva molekulaar- ja rakubioloogia osakonna juhataja Füüsika ja Tehnoloogia Instituut. Venemaa Galeni auhinna laureaat (2014), Prantsusmaa akadeemiliste palmide ordeni omanik (2016). 190 teadusartikli ja 37 patendi autor ja kaasautor. |
Viimaste aastakümnete jooksul on kogunenud tohutul hulgal teadmisi elusorganismide biokeemiliste protsesside molekulaarsetest alustest. See võimaldas mitte ainult konkreetset haigust täpselt diagnoosida, vaid ka hinnata selle esinemise tõenäosust juba enne, kui patsiendil tekivad kliinilised sümptomid, ning samuti valida tõhus teraapia. Valdav enamus sellisest teabest saadakse laboridiagnostika abil, millele kulutatakse maailmas aastas üle 100 miljardi dollari. Venemaal tehti 1970. aastal 81 biokeemilist/molekulaarset testi, 2000. aastal - 170 ja tänapäeval mõõdetakse testide arvu tuhandetes!
Enamik kõige olulisematest kaasaegsed meetodid molekulaardiagnostika põhineb inimese genoomide ja mikroorganismide struktuuri uurimisel saadud andmete analüüsil. Esiteks me räägime O polümeraasi ahelreaktsioon(PCR). Tavaliselt sisaldub DNA proovides minimaalsetes kogustes, kuid PCR abil saab nende makromolekulide teatud fragmente uuritavas biomaterjali proovis miljoneid kordi “korrutada”. "Sihtmärgid" võivad olla bakteriaalsed või viiruslikud geenid, vähkkasvajate geneetilised markerid jne. Selle meetodi abil on võimalik kindlaks teha näiteks patogeeni olemasolu isegi siis, kui selle DNA molekulid on ainult mõned molekulid. näidis.
Kümnete või sadade erinevate biomarkerite samaaegseks analüüsiks on PCR-põhiste meetodite võimalused aga piiratud. Ja siin tuleb esiplaanile juba edukalt end tõestanud tehnoloogia bioloogilised mikrokiibid(biokiibid). Selle tehnoloogia eeliseks on see, et test viiakse läbi formaadis “üks proov – üks biokiibi reaktsioonimaht”, st proovi ei ole vaja mitmeks osaks jagada ja eraldi analüüsida. See formaat suurendab oluliselt analüüsi tundlikkust ning vähendab selle töömahukust ja -kulusid, mis võimaldab kliinilise diagnostika laboritel testida kümneid ja sadu proove ühe töövahetuse jooksul.
Tänapäeval avaldavad juhtivad teadusajakirjad regulaarselt arvustusi bioloogiliste mikrokiipide kohta, mida toodavad kümned ettevõtted ja mille müük ulatub sadade miljonite dollariteni aastas. Samal ajal sündis biokiipide loomise idee alles veerand sajandit tagasi ja selle tehnoloogia üheks sünnikohaks oli nime saanud Molekulaarbioloogia Instituut. V. A. Engelhardt Vene akadeemia Sci.
Venemaa teadlaste lähenemist eristas algusest peale edukas võtmetähtsusega tehnoloogiliste lahenduste valik, tänu millele on IMB RAS-i biokiibitehnoloogiad maailmateaduses jätkuvalt konkurentsivõimelised. Paljusid neist lähenemisviisidest (näiteks radioaktiivsete märgiste asendamine fluorestseeruvatega, hüdrogeelide ja sfääriliste elementide kasutamine) on oma töös kasutanud ka teised biokiipide väljatöötamisega seotud teadlased. Alates 2000. aastast alustas IMB RAS Rahvusvahelise Teadus- ja Tehnikakeskuse toel tööd biokiipide loomisel. meditsiiniline diagnostika sotsiaalselt oluliste haiguste tekitajad.
Biokiibid töös
Iga biokiibi põhielement on sadadest ja tuhandetest mikrorakkudest koosnev maatriks, millest igaüks sisaldab nn molekulaarsonde – molekule, mis suudavad spetsiifiliselt seonduda ainult rangelt määratletud bioloogiliste molekulide või nende fragmentidega. Sondid võivad olla oligonukleotiidid, genoomse DNA lõigud, RNA, antikehad, oligosahhariidid, mitmesugused madalmolekulaarsed ühendid jne. Iga biokiibi rakk toimib omamoodi "nanotestina", kus immobiliseeritud sond tunneb analüüsitavas ära ainult oma sihtmärgi. näidis. Sel viisil on võimalik paralleelselt tuvastada korraga mitu sihtmärki, näiteks geenid, mis vastutavad haiguse patogeeni ravimiresistentsuse eest.
Põhiline erinevus Venemaa Teaduste Akadeemia Biokeemia Instituudis välja töötatud maatriks-biokiibi tehnoloogia vahel seisneb selles, et sondid ei asu tasasel substraadil, vaid poolkerakujulise hüdrogeeli polümeriseeritud “tilkades”. Molekulaarsete sondide paigutamine kolmemõõtmelisse ruumalasse, mitte tasapinnale, pakub mitmeid olulisi eeliseid. See võimaldab suurendada biokiibi mahtuvust pinnaühiku kohta kümneid ja sadu kordi ning vastavalt ka mõõtmiste tundlikkust. Lisaks välistab geel, veega küllastunud tarretisesarnane aine, võimaluse, et sondid interakteeruvad üksteisega ja substraadi tahke pinnaga, ning tagab ka üksikute rakkude suurepärase isoleerimise biokiibil.
Analüüsi tulemuste salvestamiseks kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid, mis sisestatakse proovimolekulidesse. Kui sond tuvastab sihtmärgi konkreetselt ja seostub sellega, a fluorestsents. Biokiibi rakkude luminestsentsi intensiivsust mõõdetakse spetsiaalsete riist- ja tarkvara analüsaatori komplekside abil, mis väljastavad raporti konkreetsete molekulaarsete sihtmärkide olemasolust uuritavas proovis, teavitades mikroorganismide esinemisest või geenimutatsioonid, kasvaja markerid või allergeenid jne.
IMB RASis välja töötatud originaaltehnoloogia selliste geelikiipide loomiseks patenteeriti ja sertifitseeriti vastavalt Euroopa standarditele. Selle tehnoloogia abil loodud biokiibid hõivavad eraldi diagnostiliste mikrokiipide niši ja neid kasutatakse Venemaa kliinikutes. Saksamaa ja USA juhtivate uurimis- ja tootmiskorporatsioonide toodetud kaubanduslikke mikrokiipe kasutatakse peamiselt uurimiseesmärkidel.
Venemaa on "biokiibi ehitamise" teerajaja
Filtrile immobiliseeritud või plaadi süvenditesse fikseeritud DNA ja valkudega suured maatriksid on tuntud juba pikka aega. Kuid idee luua moodsa formaadi mikrokiibid tekkis alles eelmise sajandi lõpus. Esimese töö DNA mikrokiipide kohta ja ühe esimesi valgukiipide kohta avaldas akadeemik A.D. Mirzabekov Moskva Molekulaarbioloogia Instituudist. V. A. Engelhardt NSVL Teaduste Akadeemiast (Khrapko jt . , 1989; Arenkov et al., 2000).
See revolutsiooniline idee sündis ettepanekuna uue DNA sekveneerimise meetodi kohta, kasutades hübridisatsiooni – kahe komplementaarse üheahelalise DNA molekuli ühendamise protsessi kaheahelaliseks. Tööd sekveneerimismeetodite täiustamiseks innustas kasvav huvi inimese genoomi dešifreerimise probleemi vastu.
Sel ajal arutas teadusringkond laialdaselt küsimust, kas seda probleemi tuleks lahendada olemasolevate lähenemisviiside skaleerimisega või tuleks välja töötada uued, tõhusamad. Teadlased järgisid kõigepealt esimest teed. Nii ilmus 1977. aastal “Sangeri meetod”, mis põhineb komplementaarse DNA järjestuse ensümaatilisel sünteesil analüüsitud üheahelalise DNA maatriksil, ja selle arendajad said selle 1980. aastal. Nobeli preemia. Üks laureaate, Ameerika biokeemik W. Gilbert märkis oma Nobeli kõnes, et "meetodi idee tekkis alles pärast A. Mirzabekovi teist visiiti" tema laborisse (Gilbert, 1984).
Hübridisatsiooni teel sekveneerimisel “dešifreeritakse” DNA mitte üksikute tähtede-nukleotiidide, vaid teatud suurusega “sõnade” järgi ja selline sõnastik võib sisaldada tuhandeid sõnu. Mikrokiipide loomise vajadus sai ilmseks: sel ajal avaldati esimene IMB teadlaste artikkel, mis kirjeldas geelmikrokiipide valmistamist ja omadusi (Khrapko et al., 1989).
Geel-biokiipide tootmise tehnoloogia on läbinud mitu arenguetappi. Esimese põlvkonna tehnoloogia, mis oli endiselt üsna tülikas ja ebatäiuslik, töötati välja ja patenteeriti IMB-s aastatel 1989–1993 ning seejärel rakendati instituudi ja Argonne'i riikliku labori (USA) ühislaboris ning litsentsisid Ameerika ettevõtted. Motorola Ja Packardi instrumendid. Tehnoloogiliste probleemide tõttu hakkasid ettevõtted aga tootma biokiipe, mille maatriksiks oli üleni polüakrüülamiidgeeliga kaetud pind.
IMB RASis arenes edasi geelbiokiipide tehnoloogia. Kaasaegne, üsna lihtne, universaalne ja odav tehnoloogia võimaldab isegi laboritingimustes toota sadu ja tuhandeid oligonukleotiidi, DNA või valgu mikrokiipe päevas (Kolchinsky et al., 2004).
Tuberkuloos ja ravimiresistentsus
Maailma esimene biokiipidel põhinev testimissüsteem, mis on registreeritud meditsiiniliseks kasutamiseks, oli TB-Biochip-1 komplekt, mis töötati välja IMB-s 2004. aastal. Seda saab kasutada 47 mutatsiooni olemasolu määramiseks Mycobacterium tuberculosis'e genoomis, mis põhjustavad resistentsust kahe peamise tuberkuloosivastase ravimi suhtes. rifampitsiin Ja isoniasiid.
Miks köitis tuberkuloos teadlaste tähelepanu? Fakt on see, et selle haiguse vastu võitlemiseks kasutati selle tõhususe suurendamiseks mitu aastakümmet kombineeritud ravi mitme keemiaraviga. Monoteraapiaga saavutasid patsiendid kiiresti resistentsuse ravimi suhtes. See strateegia viis aga selleni, et juba eelmise sajandi lõpus hakkas tuberkuloos levima kõikjal maailmas, sealhulgas Venemaal. multiresistentne. Just see tegur põhjustab tänapäeval kõige sagedamini ravi ebaõnnestumist ja haiguse retsidiivi, millesse sureb maailmas igal aastal üle 3 miljoni inimese.
Isoniasiid ja rifampitsiin on ühed populaarsemad ja tõhusamad esmavaliku ravimid. Ja kui patsiendist eraldatud patogeen osutub nende ravimite suhtes resistentseks, peate pöörduma teise rea (reservi) keemiaravi ravimite poole, mille suhtes see bakteripopulatsioon on tundlik. Tänapäeval on mõned kõige lootustandvamad ravimid selliste tuberkuloosivormide raviks fluorokinoloonid. Seetõttu oli MPI diagnostiliste testide seeria järgmine testisüsteem "TB-Biochip-2", mida saab kasutada ravimiresistentsuse tuvastamiseks nende ravimite erinevate klasside suhtes (Gryadunov et al., 2009).
Tuberkuloosi multiresistentsete vormide üha laialdasem levik on stimuleerinud testimissüsteemi edasist "arengut". Esiteks oli vaja maksimaalselt katta kogu geneetiliselt määratud resistentsuse spekter paljudele tuberkuloosivastastele ravimitele. Teiseks tekkis vajadus määrata isoleeritud tüve genotüüp ja vastavalt ka Vene Föderatsioonis ringlevatesse peamistesse perekondadesse kuulumine, mis on oluline mitte ainult tuberkuloosi patogeenide populatsioonistruktuuri epidemioloogiliseks jälgimiseks, vaid ka ravimite väljakirjutamiseks. piisav ravi.
Nii 2012.–2013. Laiaulatusliku genoomiuuringute tulemusena loodi maailmas analoogideta TB-TEST reaktiivide komplekt, mis võimaldab samaaegselt tuvastada 120 geneetilist lookust, mis vastutavad esimese ja teise ravimiresistentsuse tekke eest. "kaitseliin": rifampitsiin, isoniasiid, etambutool, fluorokinoloonid ja süstitavad ravimid (amikatsiin ja kapreomütsiin) (Zimenkov et al., 2016). Selline diagnostika võimaldab diferentseeritult välja kirjutada keemiaravi ravimite suurtes annustes või, vastupidi, eemaldada teatud ravimid ravirežiimidest.
Roszdravnadzori riikliku registreerimise saamiseks läbis testimissüsteem igat tüüpi testid ja eksamid ning alates 2014. aastast on see heaks kiidetud kasutamiseks Vene Föderatsiooni meditsiinipraktikas. Praegu asendab "TB-TEST" "TB-Biochipi" komplekte.
Hepatiidist vähi ja allergiateni
Teine pakiline probleem ülemaailmses tervises on C-hepatiidiga patsientide ravi. Selle põhjustaja viirushaigus Võib olla pikka aega paljunevad maksas ilma midagi ära andmata ja esimesed haigusnähud avastatakse alles paar kuud pärast nakatumist. Kuni viimase ajani peeti C-hepatiiti praktiliselt ravimatuks haiguseks ja peamiseks terapeutiline aine serveeritud kombinatsioonina interferoon Ja ribaviriin, mis sageli osutus ebaefektiivseks ja millel oli palju negatiivseid kõrvalmõjusid.
Tänaseks on loodud uusi viirusevastaseid ravimeid, millel on nn otsene viirusevastane toime ja patogeeni paljunemise peamiste intratsellulaarsete etappide blokeerimine. Kuid kogu raskus seisneb selles, et C-hepatiidi viirusel on 7 genotüübi varianti ja igal genotüübil on veel mitu alatüüpi. Lisaks on erinevatel genotüüpidel/alatüüpidel erinev tundlikkus traditsiooniliste ja uute ravimite suhtes ning viirusevastase ravi valik tuleks läbi viia vastavalt patogeeni genotüübilistele omadustele.
IMB RASis töötati koos Toulouse'i ülikooli haigla (Prantsusmaa) viroloogialaboriga välja ja patenteeriti maailmas analoogideta lähenemine, mis põhineb hüdrogeeli biokiibi platvormil C-hepatiidi viiruse tüpiseerimiseks. põhineb viiruse genoomi NS5B piirkonna analüüsil. HCV-Biochip testimissüsteem, mis suudab tuvastada selle viiruse 6 genotüüpi ja 36 alatüüpi, on edukalt läbinud kliinilised katsed Venemaal ja Prantsusmaal (Gryadunov et al., 2011).
Hüdrogeeli biokiibi tehnoloogia kõige olulisem rakendusvaldkond on inimese DNA mutatsioonide ja polümorfismide analüüs: DNA markerid, mis on seotud erinevate mittenakkuslike haiguste esinemisega.
Leukeemia on laste vähihaiguste hulgas juhtival kohal. Testsüsteem “LK-Biochip” on võimeline tuvastama 13 kõige kliiniliselt olulisemat tegurit vereproovides. kromosomaalsed translokatsioonid(ühe kromosoomi fragmendi ülekandumine teisele), mis on iseloomulik teatud tüüpi ägedale ja kroonilisele leukeemiale. Iga selline translokatsioon määrab kindlaks oma leukeemia arengu variandi ja on oluline ravistrateegia valimisel. Seda testimissüsteemi kasutatakse laste hematoloogia, onkoloogia ja immunoloogia riiklikus teadus- ja praktilises keskuses. Dmitri Rogatšov (Moskva), kus analüüsitakse proove 18 Venemaa Föderatsiooni piirkondlikust hematoloogiakeskusest (Gryadunov et al. . , 2011).
Rinna- ja munasarjavähi varajaseks diagnoosimiseks on loodud “Breast Cancer-Biochip” testisüsteem, mis võimaldab tuvastada geenides BRCA1/2 mutatsioone, mis on seotud suure (kuni 80%) esinemise tõenäosusega. nende haiguste pärilikud vormid.
Praegu töötab IMB RAS välja biokiipidel põhinevaid testsüsteemide versioone, et määrata pahaloomuliste rakkude tundlikkust kasvajavastase ravi suhtes. Näiteks biokiibi kasutamine individuaalne valik ravimid, mis toimivad tõhusalt melanoomi kasvajarakkude molekulaarsetele sihtmärkidele, on võimalik tuvastada geenimutatsioonid, mis määravad selliste ravimite kasutamise otstarbekuse suunatud("molekulaarselt suunatud") ravi melanoomi hilises staadiumis ja retsidiivides, nt trametiniib, imatiniib Ja vemurafeniib(Emeljanova jt, 2017).
Hüdrogeeli kolmemõõtmeline struktuur, milles molekulaarsed sondid on fikseeritud biokiipidele, võimaldab valgumolekulide üsna “tundlikku” natiivset struktuuri muudatusteta säilitada. Seetõttu saab selliseid biokiipe kasutada ka valgu-valgu interaktsioonide uurimiseks, mis on vajalik näiteks erinevat tüüpi immunokeemiline analüüs.
IMB RAS suutis sellise klassikalise analüüsi tõlkida mikrokiibi vormingusse ja kohandada seda diagnostikaks allergilised haigused. Koos ühe Saksa biotehnoloogia ettevõttega Dr. Fooke Laboratorien GmbH, mis andis looduslike ja rekombinantsete allergeenide komplekte, töötati välja ja patenteeriti Allergo-Biochip testimissüsteem paralleelselt. kvantifitseerimine suured allergeenispetsiifiliste antikehade E ja G4 paneelid vereseerumis (Feyzkhanova et al., 2017).
Oluline on, et 30 ja enama allergeeni antikehade analüüsimiseks biokiibil on vaja väga väikest (ainult 60 μl) kogust vereseerumit – täpselt nii palju, kui kulub ühe allergeeni analüüsiks traditsioonilisel ensüümimmuunanalüüsi meetodil! See erinevus on eriti oluline pediaatrias. Selle katsesüsteemi laboriversioon on Lastelinnas juba eelkliinilisel testimisel kliiniline haigla nr 13 nimeline. N. F. Filatova (Moskva).
Venemaa Teaduste Akadeemia Biomeditsiini Instituudis on saanud loa kasutamiseks laboridiagnostika meditsiiniseadmetena kaksteist spetsiaalset hüdrogeeli biokiibi tehnoloogia baasil loodud testsüsteemi. Neid testimissüsteeme kasutatakse edukalt enam kui 50 uurimis- ja meditsiinikeskuses Venemaa Föderatsioonis, SRÜ riikides ja ELis.
IMB RASis välja töötatud biokiibi tehnoloogiad on kaitstud 42 kodumaise ja rahvusvahelise patendiga. Ja need tehnoloogiad arenevad jätkuvalt intensiivselt. Töötatakse välja uusi lähenemisviise, et lihtsustada ja kiirendada meetodeid ning integreerida kõik analüüsietapid ühte protseduuri: alates bioloogilise proovi töötlemisest kuni kvantitatiivse tuvastamiseni reaalajas.
Süsteemi tuuma – hüdrogeeli biokiipi – muudetakse sõltuvalt diagnostilise testi eesmärgist veelgi, ülejäänud komponendid on aga juba ühtsed. Sellised "kiibil olevad laborid" parandavad oluliselt laboridiagnostika kvaliteeti, vähendavad meditsiinipersonali nakatumise tõenäosust ning lõpuks suurendavad ravi efektiivsust ja vähendavad kulusid.
Kirjandus
1.
Gryadunov D. A., Zimenkov D. V., Mihhailovich V. M. jt Hüdrogeeli biokiipide tehnoloogia ja selle rakendamine meditsiinis laboratoorne diagnostika// Meditsiiniline tähestik. 2009. Nr 3. Lk 10–14.
2.
Zasedatelev A. S. Meditsiinilise diagnostika bioloogilised mikrokiibid // Teadus ja tehnoloogia tööstuses. 2005. Nr 1. Lk 18–19.
3.
Kolchinsky A. M., Gryadunov D. A., Lysov Yu. P. jt. Kolmemõõtmelistel geelrakkudel põhinevad mikrokiibid: ajalugu ja väljavaated // Molekulaarbioloogia. 2004. E. 38. Nr 1. Lk 5–16.
4.
Arenkov P., Kukhtin A., Gemmell A. jt. Valgu mikrokiibid: kasutamine immuunanalüüsis ja ensümaatilistes reaktsioonides // Analüütiline biokeemia. 2000. V. 278. N. 2. Lk 123–131.
5.
Emelyanova M., Ghukasyan L., Abramov I. jt. BRAF-i, NRAS-i, KIT-i, GNAQ-i, GNA11 ja MAP2K1/2 mutatsioonide tuvastamine Venemaa melanoomipatsientidel LNA PCR-klambri ja biokiibi analüüsi abil // Oncotarget. 2017. V. 32. N. 8. Lk 52304–52320.
6.
Feyzkhanova G., Voloshin S., Smoldovskaya O. et al. Mikrokiibil põhineva meetodi väljatöötamine allergeenispetsiifilise IgE ja IgG4 tuvastamiseks // Kliiniline proteoomika. 2017. doi: 10.1186/s12014-016-9136-7.
7.
Gryadunov D., Dementjeva E., Mihhailovitš V. jt. Geelipõhised mikrokiibid kliinilises diagnostikas Venemaal // Molekulaardiagnostika ekspertide ülevaade. 2011. N. 11. Lk 839–853.
8.
Khrapko K. R., Lysov Yu. P., Khorlyn A. A. Oligonukleotiidide hübridisatsiooni lähenemisviis DNA järjestamisele // FEBSi kirjad. 1989. V. 256. N. 1-2. Lk 118–122.
9.
Zimenkov D. V., Kulagina E. V., Antonova O. V. jt. Mycobacterium tuberculosis'e samaaegne ravimiresistentsuse tuvastamine ja genotüpiseerimine madala tihedusega hüdrogeeli mikrokiibi abil // Antimikroobse kemoteraapia ajakiri. 2016. V. 71. N. 6. Lk 1520–1531.