9 füüsika paradoksi. Ostke Jim Al-Khalili Paradox
Optilist mikroskoopi kasutatakse laialdaselt teadus- ja tööstuslaborites, samuti meditsiinis ja bioloogias. Meditsiinis uuritakse bioloogiliste kudede kilesid ja õhukesi lõike läbiva valguse optilise mikroskoobi abil. Uuritakse kohalike ravimite kasutamist erinevaid meetodeid kontrastsed. Elusad kuded ja rakud fikseeritakse ja värvitakse erinevate värvainetega ning patoloogiat hinnatakse värvi ja varjundi järgi. Kontrastse kujutise saamiseks kasutatakse tumeda välja ja faasikontrastsuse tehnikaid, mõnikord on näidis toonitud. Geoloogiliste uuringute jaoks poleeritakse mineraale, kuni proovi paksus väheneb 50 mikronini. Pärast seda asetatakse need õhukeste klaasklaaside vahele. Polariseeritud valgust kasutatakse sageli pildi kontrastsuse suurendamiseks ja teabe saamiseks mikrokristallide orientatsiooni kohta.
Metallid on läbipaistmatud, seega tuleb nende uurimiseks kasutada peegeldunud valgust. Peegeldunud valgusega optiline mikroskoop võimaldab uurida ainult metalli pinda, mille struktuur ja optilised omadused vastutavad kontrastse kujutise loomise eest.
Polümeere saab uurida nii peegeldunud kui ka läbiva valguse käes. Amorfsed klaaspolümeerid on äärmiselt läbipaistvad, mistõttu on kontrastsete kujutiste saamine raskendatud. Seevastu kristallilisi polümeere on läbiva valguse mikroskoobi abil väga lihtne uurida. IN polariseeritud valgus mikrokristallid loovad oma optilise anisotroopia tõttu kontrastse pildi. Täidetud polümeermaatrikskomposiite saab uurida peegeldunud valguses, kuigi erinevused on suured mehaanilised omadused madala mooduliga maatriks ja kõrge mooduliga täiteaine raskendavad proovi ettevalmistamist. Lisaks on huvi nende vastu suurendanud proovide ettevalmistamise lihtsus ja skaneerivate elektronmikroskoopide kättesaadavus. Skaneeriva elektronmikroskoobi puuduseks võrreldes optilise mikroskoobiga on selle madal tundlikkus materjali anisotroopia astme suhtes. Näiteks suurte deformatsioonidega elastomeerid (kummilaadsed polümeerid) omandavad molekulaarse orientatsiooni, muutuvad optiliselt anisotroopseks ja neid saab mugavalt uurida polariseeriva optilise mikroskoobi abil.
Kuigi keraamilised ja pooljuhtmaterjalid on mineraalidega sarnased. Tavaliselt uuritakse neid peegelmikroskoobi abil, kuigi mõnel juhul on kergem õhuke plaat ülekandemikroskoobi jaoks ette valmistada. Valguse nõrk peegeldus ja tugev neeldumine vähendavad keraamiliste materjalide kujutise kontrasti peegeldunud valguses ning nende keemiline vastupidavus muudab pinnastruktuuri paljastamiseks söövitaja leidmise keeruliseks. Lisaks võib isegi väikese koguse lisandite või dopingulisandite olemasolu, mis suurendavad materjali juhtivust, põhjustada mikrofaaside sadenemist terade piiridel ja muuta proovi käitumist.
Optilise kujutise moodustamine.
Objekti kujutis optilises mikroskoobis moodustatakse klaasläätsede süsteemi abil, mille murdumisnäitaja (indeks) on kõrgem kui õhul. Pinna suhtes nurga all leviv valguskiir murdub kahe faasi vahelisel liidesel ja selle levimise suund klaasis määratakse murdumisnäitaja järgi.
Kaksikkumera läätse puhul viib selle esi- ja tagapinna sfääriline kuju selleni, et esipinnale langev paralleelne valgusvihk koguneb punktis, mis asub kaugusel f, mis on objektiivile ja objektiivile iseloomulik. nimetatakse fookuskauguseks. Kui lääts on nõgus (pinna negatiivne kõverusraadius), siis läätse taga olev paralleelkiir lahkneb nii, nagu kiirgaks selle objektiivi ees olev kujuteldav punktallikas. Seda punkti nimetatakse kujuteldavaks fookuseks ja fookuskaugust peetakse negatiivseks.
Optilise mikroskoobi disain.
Peegeldunud valgusega optilise mikroskoobi lihtsustatud kujundus on näidatud joonisel fig. 1. Mikroskoobil on kolm põhisüsteemi – valgustussüsteem, mikroskoobi alus koos lavaga ja pildisüsteem.
Valgusallikas ja kondensaator.
Valgustussüsteem peab vastama kahele vastandlikule nõudele. Ühest küljest peab uuritav ala olema ühtlaselt valgustatud, nii et kõik mikrostruktuuri detailid puutuksid kokku samade tingimustega. Teisest küljest tuleb langev valgus fokuseerida nii, et peegeldunud signaal oleks piisava intensiivsusega, et seda vaadata ja pildistada.
Valgusallikas peab olema piisavalt hele. Väikestes mikroskoopides on valgusallikaks tavaliselt vooluga kuumutatud süsinikfilament. Kallimad mikroskoobid kasutavad ksenoonlahendustorusid, mis annavad stabiilse ja võimsa valge valguse allika.
Lisaks allikale oluline element Valgustussüsteem (joonis 1) on kondensaator, mis suurendab objekti valgustuse heledust. Selleks fokusseeritakse lähtepilt objektiivi tagumise fookustasandi lähedale ja näidist valgustatakse peaaegu paralleelse kiirega. Valgustussüsteemi ava diafragma piirab allikast tuleva ja näidist tabava valguse hulka. Pildi kontrastsust saab suurendada kondensaatori ava diafragma sulgemisega. Sel juhul aga pildi heledus järsult väheneb ja võivad ilmneda difraktsiooninähtustega seotud artefaktid. Teine ava, mida nimetatakse väljaapertuuriks, asetatakse objektiivi kujutise tasapinnale (joonis 1). See asub peegeldava valgusmikroskoobi valgustusõlas, vähendab valguse peegeldust ja kõrvaldab pildilt soovimatu heleda tausta. Objektiivi ava suurust tuleb reguleerida vastavalt uuritava ala suurusele, sõltuvalt mikroskoobi suurendusvõimsusest. Ava- ja väljadiafragmad on tavaliselt iirisdiafragmad, mille läbimõõtu saab laiades piirides muuta.
Joonis 1. Peegeldunud valgusega optilise mikroskoobi konstruktsioon.
Paljudes peegeldunud valguse mikroskoopides saab valgustussüsteemi asendit koos lambiga reguleerida nii, et see hakkab töötama läbiva valguse mikroskoobina. See on väga kasulik bioloogiliste kudede, mineraalide, osaliselt kristalsete polümeeride ja õhukeste pooljuhtkilede õhukeste proovide uurimiseks.
Teema tabel.
Mikroskoobi aluse ja lava põhinõue on nende mehaaniline stabiilsus. Kui eraldusvõime on ligikaudu 0,3 µm. proovi asendi stabiilsus x-y lennuk ei tohi olla sellest piirist halvem. Täiendavad tingimused on seotud proovi paigaldamisega objektiivi fookusesse vertikaalse liikumisega (piki Oz-telge). Z-reguleerimise täpsus peab suurima suurenduse jaoks olema suurem kui objektiivi teravussügavus ja täpsemalt objektiivi numbriline ava parameeter NA. Seetõttu pole valimi asukoha stabiilsus piki z-koordinaati vähem oluline kui piki x ja y koordinaati.
Mikroskoobi reguleerimine toimub tavaliselt kõigis kolmes koordinaadis mikromeetriliste koordinaatide liikumiskruvide abil. Sel juhul peaks süsteemi mehaaniline vabadus olema minimaalne. “Vabadus” on erinevus mikromeetri kruvi asendis objekti asetamisel samasse punkti, liikudes vastassuundadest.
Objektiivi valik.
Tänapäeval on saadaval lai valik objektiive. See sõltub proovi tüübist ja vaatlusmeetodist. Objektiivi põhiomadused on numbriline ava NA ja suurendus, mis on alati leitav selle korpusel. Tavaliselt on objektiivid akromatiseeritud ja võivad töötada laias valguse lainepikkuste vahemikus ja uurida värvilisi mikrostruktuurilisi detaile.
Üks optiliste mikroskoopide tüüpilisi rakendusi on histoloogiline uuring pehmed koed. Sel juhul tuleb proovi kaitsta keskkond, mille jaoks asetatakse slaidile õhuke koelõik ja kaetakse pealt õhukese katteklaasiga. Sarnaseid meetodeid kasutatakse polümeeride, eriti amorfsete-kristalliliste polümeeride puhul. Proovide paksust saab muuta, muutes ettevalmistuse ajal katteklaasile avaldatavat survet. Selliste näidiste uurimiseks mõeldud eesmärgid on kavandatud katteklaasi murdumisnäitaja ja paksuse (0,17 mm) arvessevõtmiseks.
Pildi ehitus ja registreerimine.
Objektiivi suurendus ei ole väga suur ja seetõttu on vaja selle tekitatavat pilti veelgi suurendada. Selleks on kolm võimalust. Esimene on kasutada okulaari ning objektiivi ja okulaari vahele asetatud lisaläätsi. Teine hõlmab pildi teravustamist valgustundlikule fotofilmile ja seejärel selle suurendamist. Kolmas võimalus on skaneerida pilt ja kuvada see monitoril. IN viimased aastad Märkimisväärseid edusamme on tehtud kvaliteetsete CCD-maatriksite, mida optikas nimetatakse ka SSD-kaamerateks, väljatöötamisel, mis võimaldavad luua digitaalseid pilte. See välistas vajaduse täiendavate objektiivide järele. Praegu areneb see piltide salvestamise meetod intensiivselt.
Kirjandus:
Brandon D., Kaplan W. Materjalide mikrostruktuur. Uurimis- ja kontrollimeetodid // Kirjastaja: Tekhnosphere.2006. 384 lk.
Mikroskoop on optiline seade palja silmaga nähtamatute objektide (või nende struktuuri detailide) suurendatud kujutiste saamiseks.
Väikeste objektide vaatlemisel suure suurenduse saamiseks kasutatakse mikroskoopi. Mikroskoobis oleva objekti suurendatud kujutis saadakse optilise süsteemi abil, mis koosneb kahest lühifookusega läätsest - objektiivist O1 ja okulaarist O2. Objektiiv loob objektist tõeliselt ümberpööratud suurendatud kujutise. Seda vahepilti vaatab silm läbi okulaari, mille tegevus sarnaneb suurendusklaasi omaga. See tähendab, et pilt mikroskoobis osutub tagurpidi. Okulaar on paigutatud nii, et vahepilt on selle fookustasandil; sellisel juhul levivad kiired objekti igast punktist okulaari järel paralleelses kiirtes.
Mikroskoobi kasulik suurendus on see suurendus, mille korral objekt, mille suurus on võrdne mikroskoobi eraldusvõime piiriga, tekitab kujutise, mille suurus on võrdne silma eraldusvõime piiriga.
Mikroskoobi kasulik suurendus on objektiivi avast 500–1000 korda suurem. Mikroskoobi tavaline suurendus on see, mis saadakse 500 A ja väljuva pupilli läbimõõduga 1 mm.
Mikroskoobi kasulik suurendus on keskmiselt 1000x.
Mikroskoobi kasuliku suurenduse määrab objektiivi suurendus, seega pööratakse objektiivsete läätsede täiustamisele tõsist tähelepanu.
Mikroskoobi kasulik suurendus N tuleb valida nii, et mikroskoobi objektiivi lahutusvõimet kasutataks ratsionaalselt. Selleks on vajalik, et vaadeldava detaili kujutise nurga suurus silma pupilli keskpunkti suhtes oleks vähemalt 2 minutit ja veelgi parem, nagu tavaliselt arvatakse, kuni 4 minutit, mis on tingitud silma eraldusvõimest.
23. Mikroskoobi eraldusvõime ja eraldusvõime piir. Resolutsiooni suurendamise viisid.
Mikroskoobi üks olulisemaid omadusi on see resolutsioon. Eraldusvõime on optilise seadme võime reprodutseerida üksteise lähedal asuvate objektide kujutisi. Mikroskoobi lineaarne eraldusvõime piir, st minimaalne kaugus objekti punktide vahel, mis on kujutatud eraldi, sõltub mikroskoobi lainepikkusest ja numbrilisest avast:
Ava on optilise seadme omadus, mis kirjeldab selle võimet koguda valgust ja takistada kujutise detailide difraktsioonihägusust.
A = nSin(α/2), kus n on selle keskkonna murdumisnäitaja, milles objekt asub ja kust kiired tulevad, ning α on nurk, mille moodustavad objektilt tulevad ja ikkagi läätsesse sisenevad äärmised kiired. .
Mikroskoobi eraldusvõime suurendamiseks on kaks võimalust: kas suurendades objektiivi ava või vähendades proovi valgustava valguse lainepikkust.
24. Spetsiaalsed mikroskoopiameetodid: tumevälja meetod, polariseeriv, fluorestsentsmikroskoop.
Tumevälja uurimismeetod esmakordselt pakkus välja austerlane
teadlased R. Zsigmondy ja R. Siedentopf 1903. aastal ning sobib
objektid, mis hajutavad valgust.
Meetod põhineb preparaadi valgustamisel õõnsa valguskoonusega,
mille sisemine ava ületab kasutatava numbrilise ava
objektiiv. Kuna mitte ühtegi otsest kiirt
illuminaator ei saa objektiivi siseneda, kui
mikroskoobi objekti vaatevälja puudumine
saab pimedaks. Objekt asetatud
laval, hajutab valgust sisse
kõik küljed, sealhulgas objektiivi poole,
tänu millele on see tumedal taustal nähtav
objekti kontrastne pilt.
Läbiva valguse mikroskoobi tüüp
valgustus luuakse rõnga abil
membraanid kondensaatoris (joon. 8). Millal,
kui uurimistöös kasutatakse objektiivi
suur numbriline ava, on võimalus
et osa valgust ikka läätsesse satub.
Sel põhjusel kasutatakse neid
spetsiaalsed läätsed, millel on
sisseehitatud sisemine iirise diafragma,
mis võimaldab vähendada NAobj efektiivset väärtust väärtuseni
piisav pimedas väljas vaatlemiseks.
Polarisatsioonimikroskoopia on vaatlusmeetod polariseeritud valguses optiliselt anisotroopseid elemente sisaldavate (või täielikult sellistest elementidest koosnevate) preparaatide mikroskoopiliseks uurimiseks. Need on paljud mineraalid, terad sulamite õhukestes osades, mõned loomsed ja taimsed kuded jne. Anisotroopsete mikroobjektide optilised omadused on eri suundades erinevad ja avalduvad erinevalt sõltuvalt nende objektide orientatsioonist vaatlussuuna ja vaatlussuuna suhtes. neile langeva valguse polarisatsioonitasand. Vaatlust saab teha nii läbiva kui ka peegeldunud valguse käes. Illuminaatori poolt kiiratav valgus lastakse läbi polarisaatori. Sellele antud polarisatsioon muutub koos järgneva valguse läbimisega preparaadist (või sellest peegeldumisest). Neid muutusi uuritakse analüsaatori ja erinevate optiliste kompensaatorite abil. Selliseid muutusi analüüsides saab hinnata anisotroopsete mikroobjektide peamisi optilisi omadusi: kaksikmurde tugevust, optiliste telgede arvu ja nende orientatsiooni, polarisatsioonitasandi pöörlemist ja dikroismi.
Uurimismeetod luminestsentsvalguses (luminestsentsmikroskoopia, ehk fluorestsentsmikroskoopia) seisneb mikroskoobi all mikroobjektide rohekasoranži kuma jälgimises, mis tekib siis, kui neid valgustatakse sinakasvioletse valguse või silmale nähtamatu ultraviolettkiirtega. Mikroskoobi optilisse vooluringi sisestatakse kaks valgusfiltrit. Üks neist asetatakse kondensaatori ette. See edastab illuminaatori allika kiirgust ainult nendel lainepikkustel, mis ergutavad kas objekti enda luminestsentsi (sisemine luminestsents) või preparaati sisestatud ja selle osakestesse neeldunud spetsiaalsete värvainete luminestsentsi (sekundaarne luminestsents). Teine valgusfilter, mis paigaldatakse läätse järel, edastab vaatleja silma (või valgustundlikule kihile) ainult luminestsentsvalgust. Fluorestsentsmikroskoopia kasutab preparaatide valgustamist nii ülalt (läbi läätse, mis antud juhul toimib ka kondensaatorina) kui ka altpoolt läbi tavalise kondensaatori. Vaatlust ülalt valgustatud valguses nimetatakse mõnikord "peegeldunud valguse luminestsentsmikroskoopiaks" (see termin on suhteline - preparaadi sära ergastamine ei ole lihtne valguse peegeldus). Seda kasutatakse sageli koos vaatlusega läbiva valguse faasikontrastmeetodil. Leidis meetodi lai rakendus mikrobioloogias, viroloogias, histoloogias, tsütoloogias, toiduainetööstuses, mullauuringutes, mikrokeemilises analüüsis, vigade tuvastamises. Seda rakenduste mitmekesisust seletatakse silma väga suure värvitundlikkusega ja isehelenduva objekti kujutise suure kontrastsusega tumedal mitteluminestseeruval taustal. Lisaks on suure väärtusega teave uuritavate ainete koostise ja omaduste kohta, mida on võimalik saada nende luminestsentskiirguse intensiivsust ja spektraalset koostist teades.
Optiline mikroskoopia on meetodite kogum analüüsitud ravimiproovide palja silmaga nähtamatute osakeste vaatlemiseks ja uurimiseks optilise mikroskoobi abil.
Selle meetodi abil uuritavate osakeste suurus määratakse mikroskoobi eraldusvõimega ja see on tavaliselt 1 mikron või rohkem. Vajadusel saab aga kasutada mikroskoope kogusuurendusega üle 1500, mis võimaldab iseloomustada objekte suurusega alates 0,5 μm üksikute objektistruktuuride lahutusvõimega kuni 0,1 μm.
Kasutusala
Farmakopöa analüüsis optiline mikroskoopia kasutatakse osakeste suuruse määramiseks pehmete ravimvormide, suspensioonide, emulsioonide, aerosoolide kvaliteedi jälgimisel; ravimvormide tehnoloogias - ainete ja abiainete jahvatusastme määramiseks, samuti kristalliliste ainete uurimiseks, kuna kristallide kuju, värvus ja suurus on individuaalsed omadused ained.
Varustus
Tavaliselt on optilisel mikroskoobil kaheastmeline suurendussüsteem, mis koosneb objektiivist ja okulaarist.
Kõik mikroskoobi komponendid on paigaldatud massiivsele alusele. Alusele on paigaldatud toruhoidik, millesse on paigaldatud toru koos läätse ja okulaariga. Objektiivi all on lava, mille all on valgustussüsteem (peegel, kollektor, kondensaator). Vaatlusobjekti valgustamiseks saab kasutada nii loomulikku valgust kui ka spetsiaalseid valgusallikaid (sisseehitatud või väliseid valgustajaid).
Mikroskoopi saab varustada lisaseadmetega (faasikontrastseadmed, tumevälja kondensaatorid, polarisaatorid, analüsaatorid jne) ning olenevalt valitud vaatlusmeetodist võib olla heledaväljaga, tumeväljaga, faasikontrastne, polariseeriv. , jne.
Katseobjekt asetatakse lavale. Valgusallikast tulev valgus, läbides valgustussüsteemi, testitavat objekti ja objektiivi, siseneb okulaari või selle asemele paigaldatud salvestussüsteemi, foto- või videokaamerasse. Objekti visuaalne uurimine toimub läbi okulaari ning arvutiga ühendatud digitaalne foto- või videokaamera võimaldab objektist pilte salvestada, misjärel saab neid spetsiaalsete programmide abil pool- või täisautomaatrežiimis töödelda.
Mikroskoobi suurendus (objektiivi, okulaari ja lisakinnituste suurenduste korrutis) peab olema piisav, et adekvaatselt kirjeldada ja määrata proovi väikseimate osakeste suurusi.
Valige iga suurendusvahemiku jaoks objektiivi maksimaalne numbriline ava. Värviliste objektide kujutise kontrastsuse ja detailsuse kontrollimiseks on soovitatav kasutada suhteliselt kitsa ülekandespektriga värvifiltreid. Värvifiltreid saab kasutada ka akromaatiliste (värvitute) objektide jaoks.
Kõik optilise süsteemi elemendid reguleeritakse, fokusseeritakse ja kalibreeritakse vastavalt mikroskoobiga kaasasolevatele juhistele.
juhiseid.
Proovi ettevalmistamine
Uuritavaid proove võib uurida kas ilma sukeldusvedelikuta või seda kasutades. Kasutatava sukeldusvedeliku olemus on suuresti määratud füüsikalised omadused uuritav proov, mis ei tohiks selles lahustuda. Kui pole teisiti märgitud, kasutatakse mineraalõli ravimainete ja abiainete uurimisel sukeldusvedelikuna.
Pulbriosakesed peavad asuma samal tasapinnal ja olema hajutatud nii, et üksikud osakesed oleksid nähtavad (osakesed ei tohiks kokku kleepuda).
Lisaks tuleb proovi mikroskoopiaks ettevalmistamisel (sh sukelvedelikus dispergeerimisel) säilitada uuritavale proovile iseloomulik osakeste algne suurus ja nende suurusjaotus.
Annustamisvormid analüüsitakse lahjendamata või lahjendatakse vastavalt farmakopöa monograafiale.
Erinevalt suurendusklaasist on mikroskoobil vähemalt kaks suurendusastet. Mikroskoobi funktsionaalsed ja struktuursed ning tehnoloogilised osad on loodud tagama mikroskoobi töö ning saada objektist stabiilne, kõige täpsem, suurendatud kujutis. Siin vaatleme mikroskoobi ehitust ja proovime kirjeldada mikroskoobi põhiosi.
Funktsionaalselt on mikroskoobi seade jagatud kolmeks osaks:
1. Valgustusosa
Mikroskoobi disaini valgustusosa sisaldab valgusallikat (lamp ja elektritoiteallikas) ja optilis-mehaanilist süsteemi (kollektor, kondensaator, reguleeritavad välja ja ava/iirise diafragmad).
2. Reprodutseeriv osa
Mõeldud objekti reprodutseerimiseks kujutise tasapinnal uurimistööks vajaliku pildikvaliteedi ja suurendusega (st sellise kujutise konstrueerimiseks, mis reprodutseeriks objekti võimalikult täpselt ja kõigis detailides vastava resolutsiooni, suurenduse, kontrasti ja värviedastusega). mikroskoobi optika).
Reprodutseeriv osa annab suurenduse esimese astme ja asub pärast objekti mikroskoobi kujutise tasapinnal.
Taasesitusosa sisaldab objektiivi ja vahepealset optilist süsteemi.
Kaasaegsed mikroskoobid uusim põlvkond põhinevad lõpmatusega korrigeeritud läätsede optilistel süsteemidel. See eeldab lisaks nn torusüsteemide kasutamist, mis “koguvad” mikroskoobi kujutise tasapinnal objektiivist väljuvad paralleelsed valguskiired.
3. Visualiseerimise osa
Mõeldud objekti reaalse kujutise saamiseks silma võrkkesta, fotofilmi või plaadi, televiisori või arvutimonitori ekraanil täiendava suurendusega (teine suurenduse etapp).
Pildistamise osa asub objektiivi pilditasandi ja vaatleja (digikaamera) silmade vahel.
Pildiosa sisaldab monokulaarset, binokulaarset või trinokulaarset visuaalset kinnitussüsteemi koos vaatlussüsteemiga (okulaarid, mis töötavad nagu suurendusklaas).
Lisaks sisaldab see osa täiendavaid suurendussüsteeme (suurenduste hulgimüüja/vahetussüsteemid); projektsioonimanused, sealhulgas arutelumanused kahe või enama vaatleja jaoks; joonistusseadmed; pildianalüüsi- ja dokumentatsioonisüsteemid sobivate adapteritega digikaameratele.
Optilise mikroskoobi põhielementide paigutus
Disaini ja tehnoloogilisest vaatepunktist koosneb mikroskoop järgmistest osadest:
- mehaaniline;
- optiline;
- elektriline.
1. Mikroskoobi mehaaniline osa
Mikroskoobi seade lülitub ise sisse statiiv, mis on mikroskoobi peamine struktuurne ja mehaaniline plokk. Statiiv sisaldab järgmisi põhiplokke: alus Ja toru hoidja.
Alus on plokk, millele on kinnitatud kogu mikroskoop ja mis on üks mikroskoobi põhiosadest. Lihtsates mikroskoopides paigaldatakse alusele valgustuspeeglid või ülavalgustid. Keerulisemate mudelite puhul on valgustussüsteem põhi sisse ehitatud ilma toiteallikata või koos toiteallikaga.
Mikroskoobi aluste tüübid:
- valgustuspeegliga alus;
- niinimetatud "kriitiline" või lihtsustatud valgustus;
- Koehleri valgustus.
- läätsevahetusseade, millel on järgmised konstruktsioonivõimalused - pöörlev seade, keermestatud seade objektiivi sissekeeramiseks, “kelk” läätsede keermeta kinnitamiseks spetsiaalsete juhikute abil;
- teravustamismehhanism mikroskoobi jämedaks ja peeneks reguleerimiseks teravuse saavutamiseks - mehhanism objektiivide või lavade liikumise teravustamiseks;
- vahetatavate objektilaudade kinnituspunkt;
- paigaldusüksus kondensaatori liikumise fokuseerimiseks ja tsentreerimiseks;
- Kinnituspunkt vahetatavatele kinnitustele (visuaal-, foto-, televisiooni-, erinevad saateseadmed).
Mikroskoobid võivad komponentide paigaldamiseks kasutada aluseid (nt stereomikroskoobide teravustamismehhanismi või mõne pöördmikroskoobi mudelite valgustusseadme kinnitust).
Mikroskoobi puhtmehaaniline komponent on etapp, mis on ette nähtud vaatlusobjekti kindlasse asendisse kinnitamiseks või fikseerimiseks. Tabelid võivad olla fikseeritud, koordineeritud ja pöörlevad (tsentreeritud ja tsentreerimata).
2. Mikroskoobi optika (optiline osa)
Optilised komponendid ja tarvikud täidavad mikroskoobi põhifunktsiooni - objektist suurendatud kujutise loomine, millel on piisav kuju, koostisosade suuruse ja värvi usaldusväärsus. Lisaks peab optika tagama pildikvaliteedi, mis vastab uuringu eesmärkidele ja analüüsimeetodite nõuetele.
Mikroskoobi peamised optilised elemendid on optilised elemendid, mis moodustavad mikroskoobi valgustus- (sealhulgas kondensaatori), vaatlussüsteemi (okulaarid) ja taasesitussüsteemi (kaasa arvatud läätsed).
Mikroskoobi eesmärgid
— on optilised süsteemid, mis on loodud mikroskoopilise kujutise loomiseks kujutise tasapinnal sobiva suurendusega, elemendi eraldusvõimega ning uuritava objekti kuju ja värvi reprodutseerimise täpsusega. Objektiivid on mikroskoobi üks peamisi osi. Neil on keerukas optilis-mehaaniline disain, mis sisaldab mitut üksikut läätse ja komponente, mis on kokku liimitud 2 või 3 läätsest.
Objektiivide arvu määrab objektiivi lahendatavate ülesannete hulk. Mida kõrgem on objektiivi pildikvaliteet, seda keerulisem on selle optiline disain. Objektiivide koguarv keerukas objektiivis võib olla kuni 14 (näiteks võib see kehtida planokromaatilise objektiivi kohta, mille suurendus on 100x ja mille numbriline ava on 1,40).
Objektiiv koosneb esi- ja tagaosast. Esilääts (või läätsesüsteem) on näidise poole ja on sobiva kvaliteediga kujutise loomisel peamine, see määrab objektiivi töökauguse ja arvulise ava. Järgnev osa koos esiosaga tagab vajaliku suurenduse, fookuskauguse ja pildikvaliteedi ning määrab ka objektiivi kõrguse ja mikroskoobi toru pikkuse.
Objektiivi klassifikatsioon
Objektiivi klassifikatsioon on märkimisväärselt suur raskem klassifitseerida mikroskoobid. Objektiivid jagunevad arvestusliku pildikvaliteedi põhimõtte, parameetriliste ja disaintehnoloogiliste omaduste ning uurimis- ja kontrastimeetodite järgi.
Vastavalt arvutatud pildikvaliteedi põhimõttele läätsed võivad olla:
- akromaatiline;
- apokromaatiline;
- tasapinnalised läätsed (plaan).
Akromaatilised läätsed.
Akromaatilised läätsed on mõeldud kasutamiseks spektrivahemikus 486-656 nm. Iga aberratsiooni korrigeerimine (akromatiseerimine) viiakse läbi kahe lainepikkuse jaoks. Need läätsed kõrvaldavad sfäärilise aberratsiooni, kromaatilise asendi aberratsiooni, kooma, astigmatismi ja osaliselt sferokromaatilise aberratsiooni. Objekti kujutis on kergelt sinakas-punaka varjundiga.
Apokromaatilised läätsed.
Apokromaatilistel objektiividel on laiendatud spektripiirkond ja akromatiseerimine toimub kolmel lainepikkusel. Samas saab tänu kristallläätsede ja spetsiaalsete klaaside kujundusse toomisele üsna hästi korrigeeritud lisaks asendikromatismile, sfäärilisele aberratsioonile, koomale ja astigmatismile ka sekundaarne spekter ja sferokromaatiline aberratsioon. Võrreldes akromaatobjektiividega on nendel objektiividel tavaliselt suurem arvava, nad annavad teravamaid pilte ja taasesitavad täpselt objekti värve.
Poolapokromaadid või mikrofluaarid.
Kaasaegsed keskmise pildikvaliteediga objektiivid.
Plaanid.
Plaanobjektiivides on korrigeeritud pildi kumerust üle välja, mis tagab objekti terava pildi kogu vaatlusvälja ulatuses. Tavaliselt kasutatakse fotograafias plaaniobjektiive, kõige tõhusamad on plan-apokromaadid.
Vajadus seda tüüpi läätsede järele kasvab, kuid need on lamedat pildivälja rakendava optilise disaini ja kasutatava optilise kandja tõttu üsna kallid. Seetõttu on tava- ja töömikroskoobid varustatud nn säästlike läätsedega. Nende hulka kuuluvad parendatud pildikvaliteediga objektiivid kõikjal: akromaadid (LEICA), CP akromaadid ja akroplanaadid (CARL ZEISS), stigmakromaadid (LOMO).
Vastavalt parameetrilistele omadustele objektiivid jagunevad järgmiselt:
- objektiivid piiratud toru pikkusega (näiteks 160 mm) ja objektiivid, mis on korrigeeritud toru pikkusega "lõpmatus" (näiteks täiendava torusüsteemiga, mille mikroskoobi fookuskaugus on 160 mm);
- väikesed objektiivid (kuni 10x); keskmise (kuni 50x) ja suure (üle 50x) suurendusega, samuti ülikõrge suurendusega (üle 100x) objektiivid;
- väikese (kuni 0,25), keskmise (kuni 0,65) ja suure (üle 0,65) numbrilise avaga objektiivid, samuti suurendatud (tavalistega võrreldes) numbrilise avaga objektiivid (näiteks apokromaatilised parandusobjektiivid, aga ka spetsiaalsed fluorestsentsmikroskoopide läätsed);
- suurendatud (võrreldes tavaliste) töökaugustega, samuti suurte ja eriti pikkade töökaugustega läätsed (pöördmikroskoobis töötamiseks mõeldud läätsed). Töökaugus on vaba kaugus objekti (katteklaasi tasapinna) ja objektiivi esiosa raami alumise serva (objektiiv, kui see ulatub välja) vahel;
- objektiivid, mis võimaldavad vaatlust tavalises lineaarväljas (kuni 18 mm); laiväljaobjektiivid (kuni 22,5 mm); ülilaia väljaga objektiivid (üle 22,5 mm);
- objektiivid on standardsed (45 mm, 33 mm) ja mittestandardsed.
Kõrgus - kaugus objektiivi võrdlustasapinnast (sissekeeratud läätse ja pöörleva seadme kokkupuutetasand) objekti tasapinnani fokuseeritud mikroskoobiga, on konstantne väärtus ja tagab kogumi parfokaalsuse. pöörlevasse seadmesse paigaldatud erineva suurendusega sarnase kõrgusega läätsed. Teisisõnu, kui kasutada objektist terava pildi saamiseks ühe suurendusega objektiivi, siis järgmistele suurendustele liikudes jääb objekti kujutis objektiivi teravussügavuse piires teravaks.
Vastavalt disainile ja tehnoloogilistele omadustele on järgmine jaotus:
- vedruraamiga objektiivid (alates numbrilisest avast 0,50) ja ilma selleta;
- läätsed, mille sees on iirise diafragma numbrilise ava muutmiseks (näiteks suurendatud numbrilise avaga objektiividel, läbiva valgusega läätsedel tumevälja meetodi rakendamiseks, peegeldunud valgusega polariseeritud läätsedel);
- korrigeeriva (juht)raamiga objektiivid, mis tagab optiliste elementide liikumise objektiivi sees (näiteks objektiivi pildikvaliteedi reguleerimiseks töötamisel erineva paksusega katteklaas või erinevate sukelvedelikega; samuti suurenduse muutmiseks sujuva - pankraatliku - suurenduse muutmisega) ja ilma selleta.
Pakkuda uurimis- ja kontrastimeetodeid läätsed võib jagada järgmiselt:
- katteklaasiga ja ilma selleta töötavad objektiivid;
- läbiva ja peegeldunud valguse läätsed (mitterefleks); luminestsentsläätsed (minimaalse siseluminestsentsiga); polariseeritud läätsed (ilma klaasi pingeta optilistes elementides, st ilma oma depolarisatsioonita); faasiläätsed (millel on faasielement - läätse sees läbipaistev rõngas); Diferentsiaalinterferentsi kontrastmeetodil töötavad DIC-läätsed (polariseerivad prismaelemendiga); epiläänid (peegelduva valgusega läätsed, mis on ette nähtud valgus- ja pimevälja meetodite pakkumiseks, nende disainis on spetsiaalselt disainitud valgustuse epipeeglid);
- keelekümblus- ja mitteimmersioonläätsed.
keelekümblus ( alates lat. immersio – keelekümblus) on vedelik, mis täidab ruumi vaatlusobjekti ja spetsiaalse sukelobjektiivi (kondensaatori ja klaasklaasi) vahel. Peamiselt kasutatakse kolme tüüpi immersioonvedelikke: õliimmersioon (MI/Oil), vesiimmersioon (WI/W) ja glütseroolimmersioon (GI/Glyc), viimast kasutatakse peamiselt ultraviolettmikroskoopias.
Keelekümblust kasutatakse juhtudel, kui on vaja suurendada mikroskoobi eraldusvõimet või selle kasutamine nõuab tehnoloogiline protsess mikroskoopia. See juhtub:
- nähtavuse suurendamine kandja ja objekti murdumisnäitaja erinevuse suurendamise kaudu;
- suurendades vaadeldava kihi sügavust, mis sõltub kandja murdumisnäitajast.
Lisaks võib keelekümblusvedelik vähendada hajutatud valguse hulka, kõrvaldades objektilt helkimise. See välistab vältimatu valguse kadu objektiivi sisenemisel.
Sukelläätsed. Sukelläätsede pildikvaliteet, parameetrid ja optiline disain arvutatakse ja valitakse immersioonkihi paksust arvestades, mida käsitletakse vastava murdumisnäitajaga lisaläätsena. Objekti ja objektiivi esiosa vahele asetatud sukeldusvedelik suurendab objekti vaatenurka (avanurka). Sukeldusvaba (kuiva) läätse arvuline ava ei ületa 1,0 (eraldusvõime on põhilainepikkuse puhul umbes 0,3 µm); keelekümblus - ulatub 1,40-ni sõltuvalt keelekümbluse murdumisnäitajast ja esiläätse valmistamise tehnoloogilistest võimalustest (sellise läätse eraldusvõime on umbes 0,12 mikronit).
Suure suurendusega keelekümblusobjektiividel on lühike fookuskaugus 1,5–2,5 mm ja vaba töökaugus 0,1–0,3 mm (kaugus proovi tasapinnast objektiivi esiläätse raamini).
Objektiivi märgistused.
Iga objektiivi andmed on märgitud selle korpusele, mis näitab järgmisi parameetreid:
- suurendus (x-kordne, korda): 8x, 40x, 90x;
- NA: 0,20; 0,65, näiteks: 40/0,65 või 40x/0,65;
- lisatähemärgistus, kui objektiivi kasutatakse erinevate uurimis- ja kontrastimeetodite jaoks: faas - Ф (Рп2 - number vastab märgistusele spetsiaalsel kondensaatoril või vahetükil), polariseeriv - П (Pol), luminestsents - Л (L), faas -luminestsents - FL ( PhL), EPI (Epi, HD) - epileenid peegeldunud valguses tumevälja meetodil töötamiseks, diferentsiaalinterferentsi kontrast - DIC (DIC), näiteks: 40x/0,65 F või Ph2 40x/0,65;
- optilise korrektsiooni tüübi märgistus: apokromaat - APO (APO), plankromaat - PLAN (PL, Plan), planakromaat - PLAN-APO (Plan-Aro), täiustatud akromaat, poolplaan - CX - stigmakromaat (Achrostigmat, CP- achromat, Achroplan), mikrofluar (poolplaan-poolapokromaat) - SF või M-FLUAR (MICROFLUAR, NEOFLUAR, NPL, FLUOTAR).
Okulaarid
Optilised süsteemid, mis on loodud vaatleja silma võrkkesta mikroskoopilise kujutise konstrueerimiseks. IN üldine vaade okulaarid koosnevad kahest läätsede rühmast: silmalääts, mis on vaatleja silmale kõige lähemal, ja väljalääts, mis on kõige lähemal tasapinnale, millel objektiiv moodustab kõnealuse objekti kujutise.
Okulaarid klassifitseeritakse samade omaduste rühma järgi nagu läätsed:
- kompenseeriva (K - kompenseerivad objektiivi suurenduse kromaatilist erinevust üle 0,8%) ja mittekompenseeriva toimega okulaarid;
- tavalised ja tasapinnalised okulaarid;
- lainurk-okulaarid (okulaari numbriga - okulaari suurenduse ja selle lineaarvälja korrutis - üle 180); ülilainurk (silma arvuga üle 225);
- pikendatud pupilliga okulaarid prillidega või ilma prillideta töötamiseks;
- vaatlusokulaarid, projektsiooniokulaarid, fotookulaarid, gamaalid;
- okulaarid sisemise sihtimisega (kasutades okulaari sees liikuvat elementi, reguleeritakse võrestiku või mikroskoobi kujutise tasapinna teravat kujutist; samuti okulaari suurenduse sujuv, pankraatiline muutus) ja ilma selleta.
Valgustussüsteem
Valgustussüsteem on oluline osa mikroskoobi kujundused ja on läätsede, diafragmade ja peeglite süsteem (vajadusel kasutatakse viimaseid), mis tagab objekti ühtlase valgustuse ja objektiivi ava täieliku täitmise.
Läbiva valgusega mikroskoobi valgustussüsteem koosneb kahest osast: kollektorist ja kondensaatorist.
Koguja.
Sisseehitatud läbiva valguse valgustussüsteemiga kollektoriosa asub valgusallika lähedal mikroskoobi põhjas ja on mõeldud helendava korpuse mõõtmete suurendamiseks. Reguleerimise tagamiseks saab kollektorit muuta liigutatavaks ja liikuda mööda optilist telge. Mikroskoobi välidiafragma asub kollektori lähedal.
Kondensaator.
Optiline süsteem Kondensaator on mõeldud mikroskoobi siseneva valguse hulga suurendamiseks. Kondensaator asub objekti (lava) ja illuminaatori (valgusallika) vahel.
Kõige sagedamini saab õppe- ja lihtsates mikroskoopides kondensaatori muuta mitte-eemaldatavaks ja liikumatuks. Muudel juhtudel on kondensaator eemaldatav osa ja valgustuse reguleerimisel toimub teravustamisliikumine piki optilist telge ja tsentreerimisliikumine risti optilise teljega.
Kondensaatori juures on alati valgustusava iirisdiafragma.
Kondensaator on üks peamisi elemente, mis tagab mikroskoobi töö erinevate valgustus- ja kontrastimeetodite abil:
- kaldus valgustus (diafragma servast keskele ja valgustusava diafragma nihe mikroskoobi optilise telje suhtes);
- tume väli (maksimaalne ava valgustusava keskelt servani);
- faasikontrast (objekti rõnga valgustus, samas kui valgusrõnga kujutis mahub objektiivi faasirõngasse).
Kondensaatorite klassifikatsioon on omaduste rühmas läätsedele lähedane:
- Kondensaatorid, mis põhinevad pildikvaliteedil ja optilise korrektsiooni tüübil, jagunevad mitteakromaatiliseks, akromaatiliseks, aplanaatiliseks ja akromaatiliseks-aplanaatiliseks;
- väikese arvulise avaga (kuni 0,30), keskmise arvulise avaga (kuni 0,75), suure arvulise avaga (üle 0,75) kondensaatorid;
- regulaarsete, pikkade ja eriti pikkade töökaugustega kondensaatorid;
- tavapärased ja spetsiaalsed kondensaatorid erinevatele uurimis- ja kontrastimeetoditele;
- Kondensaatori disain on ühekordne, kokkupandava elemendiga (eesmine komponent või suure väljaga objektiiv), keeratava esiosaga.
Abbe kondensaator- pildikvaliteedile korrigeerimata kondensaator, mis koosneb kahest mitteakromaatilisest läätsest: üks on kaksikkumer, teine on tasapinnaline kumer, mis on suunatud vaatlusobjekti poole (selle objektiivi lame külg on suunatud ülespoole). Kondensaatori ava, A = 1,20. Sellel on iirise diafragma.
Aplanaatiline kondensaator- kondensaator, mis koosneb kolmest järgmiselt paigutatud läätsest: ülemine lääts on tasapinnaline kumer (lame külg on suunatud läätse poole), millele järgneb nõgus-kumer ja kaksikkumer lääts. Parandatud seoses sfäärilise aberratsiooni ja koomaga. Kondensaatori ava, A = 1,40. Sellel on iirise diafragma.
Akromaatiline kondensaator- kondensaator on täielikult korrigeeritud kromaatilise ja sfäärilise aberratsiooni suhtes.
Tumevälja kondensaator- kondensaator, mis on loodud pimeda välja efekti saavutamiseks. See võib olla spetsiaalne või teisendada tavalisest ereda väljaga kondensaatorist, paigaldades kondensaatori iirise diafragma tasapinnale teatud suurusega läbipaistmatu ketta.
Kondensaatori märgistus.
Numbriline ava (valgustus) on märgitud kondensaatori esiküljele.
3. Mikroskoobi elektriline osa
Tänapäevased mikroskoobid kasutavad peeglite asemel erinevaid elektrivõrgust toidetavaid valgusallikaid. Need võivad olla kas tavalised hõõglambid või halogeen-, ksenoon- või elavhõbelambid. Üha populaarsemaks muutub ka LED-valgustus. Neil on tavaliste lampide ees märkimisväärsed eelised, nagu vastupidavus, väiksem energiatarve jne. Valgustusallika toiteks kasutatakse erinevaid toiteallikaid, süüteseadmeid ja muid seadmeid, mis muudavad elektrivõrgust tuleva voolu selliseks, mis sobib konkreetse seadme toiteks. valgusallikas. See võib ka olla laetavad akud, mis võimaldab ühenduspunkti puudumisel välitingimustes kasutada mikroskoope.
Mikroskoop(kreeka keelest mikros- väike ja skopeo- Ma vaatan) - optiline seade väikeste objektide ja nende palja silmaga nähtamatute detailide suurendatud kujutise saamiseks.
Esimese teadaoleva mikroskoobi lõid 1590. aastal Hollandis pärilikud optikud Sakarja Ja Hans Jansen , kes paigaldas ühe toru sisse kaks kumerläätse. Hiljem Descartes oma raamatus "Dioptrics" (1637) kirjeldas ta keerukamat mikroskoopi, mis koosneb kahest läätsest - lamedast nõgusast (okulaarist) ja kaksikkumerast (objektiiv). Optika edasine täiustamine võimaldas seda Anthony van Leeuwenhoek 1674. aastal valmistas objektiivid, mille suurendus on piisav lihtsate teaduslike vaatluste tegemiseks ja kirjeldas esmakordselt 1683. aastal mikroorganisme.
Kaasaegne mikroskoop (joonis 1) koosneb kolmest põhiosast: optiline, valgustus ja mehaaniline.
Peamised üksikasjad optiline osa Mikroskoop koosneb kahest suurendusläätsede süsteemist: okulaarist uurija silma poole ja läätsest, mis on näidise poole. Okulaarid Neil on kaks läätse, ülemist nimetatakse peamiseks ja alumist kollektiivobjektiiviks. Okulaari raamid näitavad, mida nad toodavad. suurendama(×5, ×7, ×10, ×15). Okulaaride arv mikroskoobis võib varieeruda ja seetõttu monokulaarne Ja binokkel mikroskoobid (mõeldud objekti vaatlemiseks ühe või kahe silmaga), samuti trinokkel , mis võimaldab ühendada dokumentatsioonisüsteemid (foto- ja videokaamerad) mikroskoobiga.
Objektiivid on metallraamiga suletud läätsede süsteem, mille eesmine (eesmine) lääts toodab suurenduse ning selle taga olevad korrigeerivad läätsed kõrvaldavad optilise pildi defektid. Numbrid objektiivi raamil näitavad ka seda, mida nad toodavad. suurendama (×8, ×10, ×40, ×100). Enamik mudeleid on mõeldud mikrobioloogilised uuringud, kaasas mitu objektiivi erinevad kraadid suurendus ja pöörlemismehhanism, mis on loodud nende kiireks muutmiseks - torn , mida sageli nimetatakse " torn ».
Valgustuse osa on loodud valgusvoo tekitamiseks, mis võimaldab valgustada objekti nii, et mikroskoobi optiline osa täidaks oma ülesandeid ülima täpsusega. Otsese läbiva valgusega mikroskoobi valgustusosa asub objektiivi all oleva objekti taga ja sisaldab Valgusallikas (lamp ja elektritoide) ja optilis-mehaaniline süsteem (kondensaatori, välja ja avaga reguleeritav diafragma). Kondensaator koosneb läätsede süsteemist, mis on ette nähtud valgusallikast tuleva kiirte kogumiseks ühes punktis - keskenduda , mis peab asuma vaadeldava objekti tasapinnal. Omakorda d diafragma asub kondensaatori all ja on mõeldud valgusallikast väljuvate kiirte voolu reguleerimiseks (suurendamiseks või vähendamiseks).
Mehaaniline osa Mikroskoop sisaldab osi, mis ühendavad ülalkirjeldatud optilised ja valgustusosad ning võimaldavad ka uuritavat proovi paigutada ja liigutada. Vastavalt sellele koosneb mehaaniline osa põhjustel mikroskoop ja hoidja , mille ülaosale on kinnitatud toru - õõnes toru, mis on ette nähtud objektiivi, samuti ülalmainitud torni mahutamiseks. Allpool on etapp , millele on kinnitatud uuritavate proovidega slaidid. Lava saab liigutada horisontaalselt vastava seadme abil, samuti üles-alla, mis võimaldab reguleerida pildi teravust kasutades bruto (makromeetriline) Ja täppis (mikromeetrilised) kruvid.
Suurendama, mille mikroskoop toodab, määrab objektiivi suurenduse ja okulaari suurenduse korrutis. Spetsiaalsetes uurimismeetodites kasutatakse laialdaselt lisaks valgusvälja mikroskoopiale: tumevälja-, faasikontrast-, luminestsents- (fluorestsents) ja elektronmikroskoopia.
Esmane(oma) fluorestsents esineb ilma spetsiaalne töötlemine narkootikume ja on omane paljudele bioloogiliselt toimeaineid, nagu aromaatsed aminohapped, porfüriinid, klorofüll, vitamiinid A, B2, B1, mõned antibiootikumid (tetratsükliin) ja kemoterapeutilised ained (akrihhin, rivanool). Sekundaarne (indutseeritud) fluorestsents tekib mikroskoopiliste objektide töötlemise tulemusena fluorestseeruvate värvainetega - fluorokroomidega. Mõned neist värvainetest jaotuvad rakkudes difuusselt, teised seonduvad selektiivselt teatud rakustruktuuridega või isegi teatud kemikaalidega.
Seda tüüpi mikroskoopia läbiviimiseks spetsiaalne luminestseeruvad (fluorestseeruvad) mikroskoobid , mis erineb tavapärasest valgusmikroskoobist võimsa olemasolu poolest valgusallikas (ülikõrgsurve elavhõbe-kvartslamp või halogeenhõõgkvartslamp), mis kiirgab peamiselt nähtava spektri pikalainelises ultraviolett- või lühilainelises (sini-violetses) piirkonnas.
Seda allikat kasutatakse fluorestsentsi ergutamiseks enne, kui selle kiirgav valgus läbib spetsiaalset põnev (sini-violetne) valgusfilter ja kajastub sekkumine tala jagaja rekord , katkestades peaaegu täielikult pikema lainepikkusega kiirguse ja edastades ainult selle osa spektrist, mis ergastab fluorestsentsi. Samal ajal tabab tänapäevastes fluorestsentsmikroskoobide mudelites erutav kiirgus proovi läbi läätse (!) Pärast fluorestsentsi ergastamist siseneb tekkiv valgus uuesti objektiivi, misjärel läbib okulaari ees asuvat. lukustamine (kollane) valgusfilter , lõigates ära lühilainelise põneva kiirguse ja edastades luminestsentsvalguse ravimilt vaatleja silma.
Tänu sellise valgusfiltrite süsteemi kasutamisele on vaadeldava objekti kuma intensiivsus tavaliselt madal ja seetõttu tuleks fluorestsentsmikroskoopiat läbi viia spetsiaalsetes pimendatud ruumid .
Seda tüüpi mikroskoopia tegemisel on oluline nõue ka selle kasutamine mittefluorestseeruv keelekümblus Ja ümbritsevad kandjad . Eelkõige seedripuu või muu sukelõli sisemise fluorestsentsi kustutamiseks lisatakse sellele väikeses koguses nitrobenseeni (2–10 tilka 1 g kohta). Ravimite sisaldava keskkonnana võib omakorda kasutada glütserooli puhverlahust, aga ka mittefluorestseeruvaid polümeere (polüstüreen, polüvinüülalkohol). Muidu kasutatakse luminestsentsmikroskoopiat tehes tavalisi klaasklaase ja katteklaase, mis lasevad kiirgust edasi kasutatavas spektri osas ja millel puudub oma luminestsents.
Seega on fluorestsentsmikroskoopia olulised eelised järgmised:
1) värviline pilt;
2) kõrge aste isehelenduvate objektide kontrast mustal taustal;
3) uurimisvõimalus rakulised struktuurid, neelavad selektiivselt erinevaid fluorokroome, mis on spetsiifilised tsütokeemilised indikaatorid;
4) oskus määrata rakkude funktsionaalseid ja morfoloogilisi muutusi nende arengu dünaamikas;
5) mikroorganismide spetsiifilise värvimise võimalus (immunofluorestsentsi abil).
Elektronmikroskoopia
Pandi paika teoreetilised alused elektronide kasutamisele mikroskoopiliste objektide vaatlemiseks W. Hamilton , kes lõi analoogia valguskiirte läbimise optiliselt ebahomogeenses keskkonnas ja osakeste trajektooride vahel jõuväljades, samuti de Broglie , kes esitas hüpoteesi, et elektronil on nii korpuskulaarsed kui ka lainelised omadused.
Veelgi enam, elektronide ülilühikese lainepikkuse tõttu, mis väheneb otseselt proportsionaalselt rakendatava kiirenduspingega, on teoreetiliselt arvutatud eraldusvõime piir , mis iseloomustab seadme võimet kuvada eraldi objekti väikseid, maksimaalselt paiknevaid detaile, elektronmikroskoobi jaoks on 2-3 Å ( Angstrom , kus 1Å=10 -10 m), mis on mitu tuhat korda suurem kui optilise mikroskoobi oma. Esimene pilt elektronkiirte poolt moodustatud objektist saadi 1931. aastal. Saksa teadlased M. Knollem Ja E. Ruska .
Kaasaegsete elektronmikroskoopide konstruktsioonides on elektronide allikaks metall (tavaliselt volfram), millest pärast 2500 ºС kuumutamist saadakse tulemuseks termiline emissioon elektronid emiteeritakse. Elektri- ja magnetväljade abil tekkisid elektronide vool Saate kiirendada ja aeglustada, samuti mis tahes suunas kõrvale kalduda ja keskenduda. Seega mängib läätsede rolli elektronmikroskoobis sobivalt disainitud magnetiliste, elektrostaatiliste ja kombineeritud seadmete komplekt, mida nimetatakse " elektroonilised objektiivid" .
Vajalik tingimus elektronide kiireks liikumiseks pika vahemaa tagant on ka selle loomine vaakum , sest antud juhul keskmine pikkus Elektronide vaba tee gaasimolekulidega kokkupõrgete vahel ületab oluliselt vahemaa, mille nad peavad läbima. Nendel eesmärkidel piisab, kui hoida töökambris alarõhku ligikaudu 10-4 Pa.
Vastavalt objektide uurimise olemusele jagunevad elektronmikroskoobid poolläbipaistev, peegeldav, kiirgav, raster, vari Ja peegel , mille hulgas on kaks esimest kõige sagedamini kasutatavad.
Optiline disain ülekande (edastus) elektronmikroskoop on täielikult samaväärne vastava optilise mikroskoobi konstruktsiooniga, milles valguskiir asendatakse elektronkiirega ja klaasläätsesüsteemid on asendatud elektronläätsesüsteemidega. Seega koosneb ülekandeelektronmikroskoop järgmistest põhikomponentidest: valgustussüsteem, objektikaamera, teravustamissüsteem Ja lõplik pildi registreerimisplokk , mis koosneb kaamerast ja fluorestsentsekraanist.
Kõik need sõlmed on omavahel ühendatud, moodustades nn mikroskoobi kolonni, mille sees hoitakse vaakumit. Teine oluline nõue uuritavale objektile on selle paksus alla 0,1 mikroni. Objekti lõplik kujutis moodustub pärast seda läbiva elektronkiire sobivat fokusseerimist fotofilm või fluorestseeruv ekraan , mis on kaetud spetsiaalse ainega - fosforiga (sarnaselt teleri pilditorude ekraaniga) ja muutes elektroonilise pildi nähtavaks.
Sel juhul seostatakse kujutise tekkimist ülekandeelektronmikroskoobis peamiselt elektronide erineva hajumise astmega uuritava proovi erinevate piirkondade lõikes ning vähemal määral ka elektronide neeldumise erinevustega nendes piirkondades. Kontrastsust suurendatakse ka kasutades " elektroonilised värvained "(osmiumtetroksiid, uranüül jne), seondudes valikuliselt objekti teatud piirkondadega. Kaasaegsed ülekandeelektronmikroskoobid, mis on konstrueeritud sarnaselt, pakuvad maksimaalne kasulik suurendus kuni 400 000 korda, mis vastab resolutsioon 5,0 Å juures. Tuvastatav tabil õhuke struktuur bakterirakud helistas ultrastruktuur .
IN peegeldav (skaneeriv) elektronmikroskoop kujutis luuakse elektronide abil, mis peegelduvad (hajuvad) objekti pinnakihilt, kui seda kiiritatakse pinna suhtes väikese nurga all (umbes paar kraadi). Vastavalt sellele on kujutise moodustumine tingitud elektronide hajumise erinevusest objekti erinevates punktides sõltuvalt selle pinna mikroreljeefist ja sellise mikroskoopia tulemus ise ilmneb vaadeldava objekti pinna struktuuri kujul. Kontrasti saab suurendada metalliosakeste pihustamisega objekti pinnale. Seda tüüpi mikroskoopide eraldusvõime on umbes 100 Å.